Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is een derde generatie genbewerkingstechniek die de wereld heeft gerevolutioneerd met zijn hoge doorvoerresultaten. Het is gebruikt voor de behandeling van diverse biologische ziekten en infecties. Verschillende bacteriën en andere prokaryoten (zoals archaea) beschikken ook over CRISPR/Cas9-systemen om zich te verdedigen tegen fagen. Er is gerapporteerd dat op CRISPR/Cas9 gebaseerde strategieën de groei en progressie van triple-negatieve borstkanker (TNBC) kunnen remmen door zich te richten op potentieel veranderde resistentiegenen, transcriptie en epigenetische regulatie. Deze therapeutische interventies kunnen helpen bij het aanpakken van uitdagende problemen zoals medicijnresistentie, die zelfs bij TNBC wordt waargenomen. Momenteel worden verschillende methoden gebruikt om CRISPR/Cas9 naar doelcellen te brengen, zoals fysieke (micro-injectie, elektroporatie en hydrodynamische methoden), virale (adeno-geassocieerd virus en lentivirus) en niet-virale (liposomen en lipide nanodeeltjes). Hoewel er diverse modellen zijn ontwikkeld om de moleculaire oorzaken van TNBC te bestuderen, beperkt het gebrek aan gevoelige en gerichte methoden voor het in vivo toedienen van genbewerkingstools de klinische toepassing ervan. Samenvattend onderzoekt dit overzicht uitgebreid de vooruitgang, uitdagingen, beperkingen en vooruitzichten van CRISPR/Cas9-behandeling voor TNBC op basis van bestaande gegevens. We belichten tevens hoe de combinatie van kunstmatige intelligentie en machinaal leren de CRISPR/Cas9-strategieën bij de behandeling van TNBC kan verbeteren.
Kanker wordt gekenmerkt door ongecontroleerde celdeling, verstoring van de celcycluscontrolepunten en mutaties in tumorsuppressorgenen (TSG's) (Matthews et al., 2022). Van de verschillende soorten kanker is borstkanker de meest voorkomende vorm van kanker bij vrouwen en kent wereldwijd een hoog sterftecijfer (Waks en Winer, 2019). Borstkanker is een heterogene ziekte met diverse kenmerken, zoals histologische en biologische eigenschappen, klinische presentatie en gedrag, en respons op de behandeling (Weigelt et al., 2010). Borstkankerclassificatie biedt nauwkeurig inzicht in de diagnose en prognose van borstkanker. Het gebruik van gangbare biomarkers en klinisch-pathologische kenmerken is het belangrijkste criterium voor de classificatie van borstkanker (Tsang en Tse, 2019). De prognose en respons op de behandeling van borstkanker worden beïnvloed door tal van factoren, waaronder de aanwezigheid van oestrogeenreceptoren (ER), progesteronreceptoren (PR), humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2/neu), histologische graad, tumortype, tumorgrootte en lymfekliermetastasen (Al-Tubaiti, 2020). Er zijn vijf intrinsieke moleculaire subtypes van borstkanker geïdentificeerd, waaronder luminaal A, luminaal B, HER2-verrijkt, basaal-achtig en claudine-laag (Prat et al., 2015). TNBC is een moleculair subtype van kanker dat niet alle ER, PR en HER2 tot expressie brengt (Yin et al., 2020). Deze pathologische kenmerken worden geassocieerd met TNBC, wat de snelle progressie en het agressievere karakter ervan bevestigt in vergelijking met andere vormen van borstkanker (Feng et al., 2018). Daarnaast gebruikten Peru et al. (2000) microarraytechnologie om borstkanker opnieuw te classificeren en vijf intrinsieke subtypes van borstkanker te identificeren (Cadenas, 2012). Basaalcelcarcinoom is een subtype van borstkanker met een triple-negatief fenotype en wordt geassocieerd met snelle progressie. Het is belangrijk op te merken dat alle basaalcelcarcinomen vaak ten onrechte worden gediagnosticeerd als TNBC, terwijl slechts 77% daadwerkelijk TNBC is. Daarentegen is 71-91% van de TNBC basaalcelcarcinoom, wat aangeeft dat deze twee typen borstkanker elkaar overlappen en verschillende classificaties vertegenwoordigen (Wang D.-Y. et al., 2019). Dit creëert de behoefte om de heterogeniteit van TNBC te karakteriseren om de prognose te verduidelijken en potentiële responsen op huidige en toekomstige behandelingen te identificeren. Bovendien vertegenwoordigt TNBC 15-20% van alle borstkankergevallen en komt het vaker voor bij vrouwen onder de 50 jaar. BRCA1- of BRCA2-mutaties zijn gerapporteerd in ongeveer 20% van de TNBC-gevallen (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Studies hebben ook aangetoond dat TNBC een specifiek immuunmicro-omgeving heeft met hoge concentraties vasculaire endotheliale groeifactoren, tumor-geassocieerde macrofagen (TAM's), tumorinfiltrerende lymfocyten (TIL's) en andere moleculen die betrokken zijn bij tumorgroei en -migratie. Het begrijpen van de micro-omgeving van TNBC is daarom cruciaal voor de prognose en behandeling ervan (Fan en He, 2022).
Om de prognose van TNBC te beoordelen en een effectieve behandeling te garanderen, is een nauwkeurige diagnose, voornamelijk gebaseerd op immunohistochemie (IHC) voor de detectie van ER, PR en HER2, en mammografie voor de detectie van borsttumoren, van belang. Mammografie kan echter intratumorale kenmerken zoals necrose en fibrose niet adequaat in beeld brengen (Deepak Singh et al., 2021). Omdat een slechte prognose en diagnose artsen ervan weerhouden de juiste medicatie voor te schrijven (Chaudhary, 2020), worden verschillende strategieën gebruikt om de zorg voor patiënten met TNBC te verbeteren. Momenteel worden twee geneesmiddelen, doxorubicine en cyclofosfamide, gebruikt bij patiënten met TNBC en hebben goede resultaten laten zien. Daarnaast worden andere platinapreparaten gebruikt, zoals carboplatine en cisplatine (Sikov et al., 2015). Daarnaast zijn PARP-remmers zoals Olaparib, Velaparib en PF-01367338 gebruikt als potentiële chemotherapeutische geneesmiddelen voor de behandeling van TNBC (Ishino et al., 2018). Aangezien is gerapporteerd dat de Wnt/β-Catenin-, NOTCH- en Hedgehog-signaalroutes betrokken zijn bij het ontstaan en de progressie van TNBC, kan het richten van geneesmiddelen op deze routes een belangrijke strategie zijn (Aysola et al., 2013). Hoewel chirurgie, radiotherapie en chemotherapie nog steeds de belangrijkste behandelingen voor TNBC vormen, is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in de ontwikkeling van nieuwe behandelingen, waaronder doelgerichte therapie, immunotherapie en diverse CRISPR-gerelateerde genbewerkingstechnieken zoals Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing en CRISPR/Cas9-gerichte gentherapie. Hier zullen we ons richten op verschillende CRISPR-gerelateerde genbewerkingstechnieken die worden gebruikt bij de behandeling van TNBC. CRISPR/Cas9 heeft daarbij veel aandacht gekregen.
Cas9n, ook bekend als Cas9-nickase, is een genetisch gemodificeerde variant van het Cas9-eiwit, afkomstig van het CRISPR/Cas9-genbewerkingssysteem (Gupta et al., 2019). In zijn oorspronkelijke vorm bevat het Cas9-eiwit twee nucleasedomeinen: RuvC en HNH, waarvan de belangrijkste functie het splitsen van beide DNA-strengen is. In Cas9n is echter een van de nucleasedomeinen, HNH, genetisch gemuteerd en inactief geworden. Daardoor blijft het HNH-domein van Cas9n niet-functioneel. Alleen het RuvC-domein blijft actief, waardoor Cas9n enkelstrengs DNA kan knippen of breken (Trevino en Zhang, 2014). In vergelijking met Cas9 kan Cas9n off-target effecten effectief verminderen en de celreparatiemechanismen nauwkeurig verbeteren. Cas9n kan worden gebruikt om diverse problemen op te lossen, zoals het creëren van breuken op specifieke locaties in dubbelstrengs DNA. Hiervoor werden twee Cas9n-moleculen gecombineerd en samen gebruikt (Yee, 2016). Mixed lineage kinase 3 (MLK3) is een mitogeen-geactiveerd proteïnekinase dat fungeert als een belangrijke regulator tijdens TNBC-metastase (Cronan et al., 2012).
MLK3 kan meerdere signaalroutes activeren die leiden tot metastase van TNBC. Zo reguleert de c-Jun N-terminal kinase (JNK)-route de celmotiliteit en de afbraak van de extracellulaire matrix, en activeert MLK3 de JNK-route, waardoor de celmotiliteit wordt versterkt en invasieve eigenschappen worden verkregen (Rattanasinchai en Gallo, 2016). MLK3 reguleert ook EMT. Hiervoor activeert het stroomafwaartse transcriptiefactoren zoals Snail, Slug en Twist. Deze factoren remmen de expressie van epitheliale markers en bevorderen de expressie van mesenchymale markers, wat leidt tot het verwerven van een metastatisch fenotype (Casalino et al., 2023). Er is waargenomen dat MLK3 een rol speelt bij de hermodellering van de extracellulaire matrix en de activering van proteasen zoals matrixmetalloproteïnasen (MMP's) die de extracellulaire matrix afbreken. Dit vergemakkelijkt de invasie en verspreiding van tumorcellen naar verre locaties (Katari et al., 2019). Eerdere studies hebben dus aangetoond dat MLK3 een cruciale rol speelt bij TNBC. Rattanasinchai en Gallo gebruikten TNBC-modellen om de rol van MLK3 te bestuderen en ontdekten dat het de ontwikkeling van kanker bevordert via specifieke signaalroutes. Ze gebruikten CRISPR/Cas9n om MLK3 te modificeren en observeerden een significante vermindering van TNBC-metastasen (Rattanasinchai en Gallo, 2016).
dCas9, vaak inactief Cas9 genoemd, is een gemodificeerde afgeleide vorm van het Cas9-eiwit. In tegenstelling tot actief Cas9 mist dCas9 endonuclease-activiteit, waardoor het geen dubbelstrengs DNA-breuken kan veroorzaken. Daarom kan dCas9 worden gebruikt om specifieke regio's van het genoom nauwkeurig te targeten zonder veranderingen of modificaties aan de DNA-sequentie (Wang et al., 2016). In dCas9 worden twee endonuclease-eiwitten, RuvC en HNH, geïnactiveerd door belangrijke aminozuurresiduen te onderdrukken (Richter et al., 2016). Ondanks het ontbreken van DNA-knippende activiteit speelt dCas9 een aantal belangrijke rollen in genetisch onderzoek en biotechnologie. Zo maakt het bijvoorbeeld visualisatie van specifieke regio's van het genoom mogelijk, vergemakkelijkt het transcriptieregulatie en bevordert het epigenetische modificaties (Brocken et al., 2018).
De transcriptiefactor ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) speelt een specifieke en cruciale rol bij de bemiddeling van epitheliale-mesenchymale transitie (EMT), een cellulair proces dat plaatsvindt tijdens de embryonale ontwikkeling, weefselherstel en kankerprogressie. Het omvat de transformatie van epitheliale cellen in mesenchymale cellen, wat resulteert in veranderingen in celmorfologie, beweeglijkheid, invasiviteit, enz. (Wu et al., 2020). ZEB1 remt meerdere epitheliale markers, zoals E-cadherin en Occludin, die verantwoordelijk zijn voor het handhaven van cel-celadhesie en polariteit van epitheliale cellen in TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Bovendien activeert ZEB1 bepaalde markers zoals N-cadherin, vimentine en fibronectine (Konradi et al., 2014) en reguleert het ook genen die betrokken zijn bij de hermodellering van het cytoskelet, zoals Rho GTPasen en matrixmetalloproteïnasen (MMP's) (Huang et al., 2014). Daarnaast beïnvloedt het ook verschillende signaalroutes, zoals transformerende groeifactor-β (TGF-β), Wnt-signalering, enz., waardoor tumorinvasie en metastase bij TNBC worden bevorderd (Chen et al., 2016). Talrijke studies en wetenschappelijke bewijzen tonen aan dat ZEB1 een groot potentieel heeft als waardevol middel voor de detectie en therapeutische interventie van TNBC. In een recente studie gebruikten Waryah et al. een TNBC-model en bereikten ze een volledige onderdrukking van ZEB1 door dCas9. Zo observeerden ze een zeer hoge specificiteit en een bijna volledige remming van ZEB1 onder in vivo omstandigheden (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 is een genbewerkingstool die ook wel CRISPR/Cpf1 wordt genoemd. Het is afgeleid van het CRISPR/Cas-systeem, waarbij de term Cas12 verwijst naar CRISPR-geassocieerd eiwit 12 (Bharathkumar et al., 2022), dat volledig identiek is aan Cas9. Het enige verschil is dat het het Cas12-eiwit bevat. In vergelijking met Cas9 heeft Cas12 enkele unieke functies, zoals het genereren van kleverige uiteinden tijdens het genbewerkingsproces, terwijl Cas9 stompe uiteinden genereert (Wang et al., 2021). Deze eigenschap van Cas12 draagt bij aan de specifieke DNA-manipulatietechnologie. Als een eiwit dat in staat is om doel-DNA nauwkeurig te herkennen en te knippen, heeft het een buitengewone veelzijdigheid, waardoor het een effectief hulpmiddel is voor diverse toepassingen, waaronder genbewerking (Pickar-Oliver en Gersbach, 2019).
Net als andere CRISPR-varianten is CRISPR/Cas12 ook in staat om genen in TNBC uit te schakelen of te activeren, met name genen die een belangrijke rol spelen in de pathogenese of de respons op de behandeling (Yang en Zhang, 2023). Om dit proces te bewerkstelligen, is een gids-RNA (gRNA) ontwikkeld dat Cas12 naar het doelgen leidt. Zodra Cas12 zich aan zijn doelwit bindt, introduceert het dubbelstrengsbreuken in het DNA en activeert het DNA-reparatiemechanismen. Tijdens het reparatieproces kunnen onjuiste nucleotiden worden ingebouwd, wat leidt tot genmutaties en functieverlies (Zhang et al., 2021a). Daarnaast is ook een verbeterde versie van het Cas12-enzym (dCas12 genaamd) gebruikt om genen te activeren. Door het te combineren met een transcriptieactivator is het mogelijk om bepaalde genen te induceren en zo te activeren. Deze technologie heeft een groot potentieel voor het bevorderen van de activering van tumorsuppressorgenen (Sultan et al., 2022).
Prime editing is een recent ontwikkelde en uiterst geavanceerde technologie voor genoommodificatie. Het is in staat om het DNA van een organisme zeer nauwkeurig te modificeren (Chen en Liu, 2023). Prime editing wordt bereikt door de integratie van twee hoofdcomponenten: een gemodificeerd CRISPR/Cas9-enzym en reverse transcriptase. De rol van het CRISPR/Cas9-enzym is het selectief targeten van precieze locaties in het genoom, terwijl reverse transcriptase helpt om het DNA op de doellocatie grondig te modificeren (Hassan et al., 2021). In het primer editing-mechanisme omvat de eerste stap de creatie van een primer editing guide RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Dit bevat de doelsequentie en een RNA-template die overeenkomt met de gewenste bewerkingslocatie in het doel-DNA. Het pegRNA wordt vervolgens samen met een primer editing nuclease (PE2) in de doelcellen geïntroduceerd. PE2 is een fusie-eiwit dat bestaat uit een Cas9-enzym, een reverse transcriptase en een primer editing-adapter (Martín-Alonso et al., 2021). Binnen de cel zoeken pegRNA- en PE2-complexen naar het specifieke DNA dat ze willen modificeren. Het Cas9-enzym knipt het DNA en creëert een template bestaande uit enkelstrengs DNA (Choi et al., 2022). Reverse transcriptase gebruikt deze template om het DNA voor te bereiden op de bewerking. Naast het kopiëren van DNA worden ook instructies voor het bewerken van de RNA-template toegevoegd. Ten slotte wordt de nieuw gecreëerde DNA-streng gebruikt als template om de breuk in het DNA te herstellen, wat resulteert in een gewijzigde DNA-sequentie met de gewenste modificatie (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Primer-editingmechanismen kunnen leiden tot wijdverspreide mutaties in genen. Het kan zich richten op puntmutaties, inserties, deleties en zelfs genvervangingen (Anzalone et al., 2019; Chen en Liu, 2023). Primer-editing biedt verschillende voordelen ten opzichte van eerdere technologieën voor genoomeditie. Deze omvatten een verhoogde nauwkeurigheid, verminderde off-target effecten en de mogelijkheid om DNA te bewerken zonder afhankelijk te zijn van dubbelstrengs DNA-breuken (Anzalone et al., 2020).
De CRISPR/Cas9-technologie werd oorspronkelijk ontwikkeld om bacteriën te beschermen tegen plasmideoverdracht en faaginfectie en werd later hergebruikt als een effectief RNA-gebaseerd DNA-gericht hulpmiddel voor genoomeditie (Jiang en Doudna, 2017). Bovendien is het CRISPR/Cas9-systeem naar verluidt aanwezig in respectievelijk 50% en 87% van de bacteriële en archaeale genomen (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 is een potentieel hulpmiddel voor deletie, insertie en correctie van elke abnormale genetische sequentie met behulp van in vivo en in vitro methoden (Sabit et al., 2021). Verder is aangetoond dat CRISPR/Cas9 deel uitmaakt van het adaptieve immuunsysteem vanwege de specificiteit ervan voor doelgenen van belang (Chen en Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 bestaat uit Cas9 en een enkelvoudig gids-RNA (sgRNA). Cas9 is een endonuclease die is opgebouwd uit meerdere eiwitcomponenten. Daarnaast heeft Cas9 unieke structurele en conformationele eigenschappen (Pacesa et al., 2022), aangezien het bestaat uit twee lobben: een herkenningslob (REC) en een nucleaselob (NUC). De REC-lob is verder onderverdeeld in drie regio's: REC1, REC2 en brughelices (Cromwell et al., 2018). De NUC bestaat uit drie lobben, namelijk RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH en het protospacer adjacent motif (PAM) interactiedomein (Fig. 1) (Song et al., 2016). sgRNA bestaat uit twee componenten, waaronder CRISPR-RNA (crRNA) en transcoderend klein RNA (tracer-RNA) (Figuur 1). Het sgRNA verbindt het Cas9-eiwit met connexines om een actief complex te vormen, ook wel het effectorcomplex genoemd (Richter et al., 2012). crRNA is een basenpaar van 18-20 nucleotiden dat een cruciale rol speelt bij het herkennen van doel-DNA-sequenties. Daarnaast paart crRNA met het doel-DNA, en fungeert tracrRNA als een steiger voor het Cas9-nuclease om aan het doel-DNA te binden (Manghwar et al., 2019). De PAM-sequentie daarentegen bestaat uit 3 nucleotiden, die de binding van het effectorcomplex aan DNA bevestigen, specificeren en mediëren. De subunits RuvC en HNH van het Cas9-eiwitcomplex hebben katalytische activiteit (Richter et al., 2012; Asmamaw en Zawdie, 2021). Het HNH-nucleasedomein van de Cas9-subunit splitst de DNA-streng die geassocieerd is met het crRNA. Het RuvC-nucleasedomein splitst andere DNA-strengen en genereert dubbelstrengsbreuken (DSB's), waarna twee verschillende DNA-breukreparatiemechanismen worden geactiveerd (Jiang en Doudna, 2017) (Figuur 1).
Figuur 1. Overzicht van CRISPR/Cas9 (A). Componenten van het CRISPR/Cas9-systeem: (i). Cas9-endonuclease is verantwoordelijk voor het knippen van de doel-DNA-sequentie, (ii) een enkelvoudig gids-RNA (sg-RNA) dat ontstaat door de fusie van crRNA- en tra-crRNA-chimeren. (2). Cas9 omvat verschillende componenten zoals Rec I, Rec II, NUC-lob (HNH en Ruv C zijn subcomponenten) en PAM-interactiedomein (C) met corresponderende functies. Het CRISPR/Cas9-eiwitcomplex splitst DNA-sequenties in niet-complementaire en complementaire vormen (D). CRISPR/Cas9 bewerkt het genoom in drie fasen: herkenning, knippen en reparatie. Het ontworpen sg-RNA leidt Cas9 en herkent de gewenste sequentie via de complementaire component crRNA. Cas9 herkent de PAM-sequentie op 5′-NGG-3′ en smelt het DNA, waardoor een DNA-RNA-hybride wordt gevormd en de splitsing wordt geactiveerd. Het HNH-domein van Cas9 knipt de complementaire streng, en het RuvC-domein knipt de niet-complementaire streng. CRISPR/Cas9 repareert dubbelstrengs-DNA door het op twee manieren te breken: niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologie-gerichte reparatie (HDR). NHEJ repareert dubbelstrengs-DNA in afwezigheid van vreemd homoloog DNA via een enzymatisch proces, een foutgevoelig mechanisme dat willekeurige DNA-sequenties kan invoegen of verwijderen. HDR is zeer specifiek en vereist homologe DNA-templates.
CRISPR/Cas9-gemedieerde reparatiepaden omvatten niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologie-gerichte reparatie (HDR). NHEJ is een foutgevoelig pad omdat het insertie of deletie omvat en geen specifiek patroon vereist tijdens het reparatiemechanisme. Het gebruikt willekeurige nucleotiden om standaardproteïnen te genereren (Abbasi et al., 2021). Dit reparatiesysteem bestaat uit vier complexen, zoals het KU-complex, het cross-complementerende proteïnecomplex type 4 (XRCC-4), het DNA-eindverwerkingsenzym en het proteïnekinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Het KU-complex-eiwit bestaat uit twee subeenheden, Ku 70 en Ku 80, en speelt een belangrijke rol in het NHEJ-mechanisme, aangezien het reparatiemechanisme wordt geïnitieerd door de binding van deze twee subeenheden (Ku 70 en Ku 80) aan de stompe of bijna stompe uiteinden van het doel-DNA (Abbasi et al., 2021). Ze dienen als een steiger om andere NHEJ-gerelateerde factoren naar de plaats van de beschadiging te rekruteren (Yang et al., 2020). XRCC-4 en DNA-ligase bestaan respectievelijk uit 334 en 911 aminozuren, en het XRCC4-DNA-ligase IV-complex stimuleert de ligatie van DNA-uiteinden (Chatterjee et al., 2015). DNA-eindverwerkingsenzym, ook bekend als polynucleotidekinase 3'-fosfaat, is een enzym dat DNA-uiteinden verwerkt. Het kan de 3'P-groep in DNA verwijderen en de 5'OH-groep fosforyleren tijdens de reparatie van dubbelstrengsbreuken. Het omvat ook het herstel van enkelstrengsbreuken (SSB's) met behulp van het SSB-herstelpad (Chatterjee et al., 2015). Proteïnekinase DNA-PKcs is een DNA-afhankelijke proteïnekinase die bestaat uit een katalytische subunit van de PIKK's (fosfatidylinositol 3-kinase-gerelateerde kinases) en de ATM-familie (ataxia telangiectasia mutated), evenals ATM- en Rad3-gerelateerde ATR's. Het herstelt dubbelstrengsbreuken (DSB's) en enkelstrengsbreuken (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR is een nauwkeuriger en geschikter reparatiemechanisme omdat de informatie wordt gekopieerd met behulp van de intacte vorm van de homologe DNA-dubbelstreng, hoewel de aanwezigheid van zusterchromatiden vereist is. Dit vindt plaats tijdens de S/G2-fase van de celcyclus van zoogdieren. HDR komt voornamelijk voor in gistsoorten, maar NHEJ is cruciaal bij zoogdieren (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Het volledige reparatiemechanisme wordt weergegeven in Figuur 1.
Aangezien TNBC wordt veroorzaakt door genetische en epigenetische afwijkingen, kan correctie van kwaadaardige genomische/epigenomische afwijkingen met behulp van CRISPR/Cas9 een redelijke therapeutische benadering zijn (Chen et al., 2019). Bovendien kunnen sommige transcriptiefactoren die betrokken zijn bij celspecifieke transcriptionele regulatie unieke kenmerken van kankercellen vertonen, wat suggereert dat transcriptionele regulatie een uitstekende benadering kan zijn voor kankerbehandeling (Drost et al., 2017). Het benutten van deze moleculaire kenmerken van tumoren, zoals genetische, epigenetische en transcriptionele defecten, voor de ontwikkeling van geneesmiddelen kan de klinische resultaten verbeteren en de screeningskosten verlagen. CRISPR is een potentieel genbewerkingstool dat niet alleen kankerverwekkende genomische doelen kan detecteren en identificeren, maar ook kan worden gebruikt om oncogenen in menselijke cellen te bewerken, te onderdrukken en epigenetisch te modificeren (Tabel 1) (Ahmed et al., 2021). Er zijn verschillende CRISPR-screens uitgevoerd om te zoeken naar genen die geassocieerd zijn met tumorsuppressoren, oncogenen en resistentie tegen geneesmiddelen. Het gebruik van CRISPR/Cas9 voor het bewerken van verschillende TNBC-oncogenen wordt weergegeven in figuur 2.
Figuur 2. Genbewerking van verschillende TNBC-oncogenen met behulp van CRISPR/Cas9, resulterend in verminderde tumorgroei en metastase. Deze oncogenen omvatten CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 en CXCR7, Crypto1, ROR1 en ST8SIA, die betrokken zijn bij het ontstaan en de metastase van TNBC.
Migratie, invasie en epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) van kankercellen worden geassocieerd met ITGA9. Eerdere studies hebben aangetoond dat ITGA9 een belangrijke speler is in de Notch-signaalroute en een interessante rol speelt bij de metastase van rhabdomyosarcoom (Molist et al., 2020). Bovendien bleek ITGA9 nauw verband te houden met de prognose van patiënten met verschillende tumortypen, waaronder borstkanker (Wang Z. et al., 2019). Bio-informatische analyse van ITGA9 toonde aan dat de expressie ervan in TNBC significant hoger was dan in andere subtypes van borstkanker. Verhoogde ITGA9-niveaus worden geassocieerd met tumormetastase en terugval bij TNBC-patiënten. Uitschakeling van ITGA9 met CRISPR/Cas9 resulteerde in kankerstamcelachtige eigenschappen, tumorangiogenese, tumorgroei en verminderde metastase door de afbraak van β-catenine te bevorderen in TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Crypto-1 is een lid van de TGF-β-familie en is cruciaal voor de vroege embryogenese, het behoud van stamcellen en de metastase van kanker (Ishii et al., 2021). Ook bekend als Tdgf-1, is het een oncogeen GPI-verankerd signaaleiwit dat betrokken is bij de regulatie van de vorming van de primitieve streep, het mesoderm en het endoderm, evenals de totstandkoming van links/rechts-asymmetrie in de ontwikkeling van lichaamsorganen tijdens de embryogenese (Zhang et al., 2021b). Daarnaast is aangetoond dat Crypto-1 betrokken is bij de epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) als stamcelmarker (Zhang et al., 2021b). EMT is niet alleen cruciaal voor diverse processen zoals embryonale ontwikkeling, fibrose en wondgenezing, maar ook voor kankerinvasie en metastase. Bovendien is aangetoond dat Crypto-1 interactie aangaat met vier Notch-receptoren en hun post-translationele rijping bevordert (Brandstadter en Maillard, 2019). Het Notch-signaleringspad speelt een rol in het in stand houden van menselijke borstkankercellen. Studies hebben aangetoond dat CRISPR/Cas9-gemedieerde uitschakeling van Crypto-1 de groei en metastase van kanker onderdrukt. Daarom zou Crypto-1 een belangrijk therapeutisch doelwit kunnen worden voor TNBC (Castro et al., 2015).
Het XCL12-eiwit en de bijbehorende chemokine-receptoren CXC (CXCR4 en CXCR7) spelen verschillende rollen bij de proliferatie, groei, migratie en invasie van kankercellen (Wu et al., 2015). Deze chemoreceptoren zijn in verband gebracht met de ontwikkeling van TNBC via meerdere signaalroutes in zowel in vivo als in vitro modellen (Wu et al., 2015). Bovendien is activering van CXCR4 en CXCR7 geassocieerd met een grotere vatbaarheid voor metastasen en een slechte prognose bij TNBC (Karn et al., 2022). Daarom zou het uitschakelen van CXCR4 en CXCR7 effectieve doelwitgenen kunnen opleveren voor de behandeling van borstkanker, waaronder TNBC. Studie door Yang et al. Yang et al. (2019) gebruikten CRISPR/Cas9 om de CXCR4- en CXCR7-genen gezamenlijk uit te schakelen en ontdekten dat de proliferatie, groei, migratie en invasie van TNBC significant werden geremd (Yang et al., 2019).
Verhoogde niveaus van miR-3662, een TNBC-oncogen, werden waargenomen in borstkankerweefsel (Yi et al., 2022). Uit onderzoek is gebleken dat het uitschakelen van miR-3662 de tumorgroei en metastase van borstkanker remt, zowel in vivo als in vitro (Agarwal en Gupta, 2021). HBP-1 is een krachtige remmer van de Wnt/β-catenine-signalering en is waarschijnlijk verantwoordelijk voor de door miR-3662 gemedieerde groei van TNBC-cellen. Recentelijk ontdekten Yi et al. dat de miR-3662-HBP1-as de Wnt/β-catenine-signaleringsroute in TNBC-cellen reguleert (Yi et al., 2022). Vanwege de tumorspecifieke expressie zou miR-3662 een potentieel therapeutisch doelwit kunnen zijn voor TNBC. Het uitschakelen van miR-3662 met behulp van CRISPR/Cas9 kan daarom een uitstekende aanpak zijn voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van TNBC.
UBR5 is een nucleofosfoproteïne van 300 kDa dat is geïdentificeerd als een belangrijke regulator van tumorigenese, metastase en immuunrespons in verschillende kankersoorten (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Er is gerapporteerd dat UBR5 sterk verhoogd tot expressie komt in TNBC-monsters en de ERα-functie stimuleert door proliferatie te induceren via zijn ubiquitine-ligase-activiteit (Bolt et al., 2015). Studies met behulp van whole exome sequencing van primaire TNBC-monsters toonden ook een verhoogde expressie van UBR5 aan, wat suggereert dat het een rol speelt in de ontwikkeling van TNBC. Bovendien leidde CRISPR/Cas9-gestuurde deletie van UBR5 tot een significante remming van TNBC-metastase en -groei in experimentele muismodellen. Verder herstelde de inclusie van UBR5 in een wildtype muismodel de volledige functionaliteit ervan, terwijl dit effect niet werd waargenomen in geïnactiveerde mutante stammen (Liao et al., 2017). Een tekort aan UBR5 wordt geassocieerd met verhoogde apoptose, necrose en remming van tumorgroei in TNBC als gevolg van slechte angiogenese. Door het verlies van UBR5 wordt de tumoruitzaaiing naar verre organen verminderd en induceert UBR5 abnormale EMT, voornamelijk door de expressie van E-cadherine te verlagen (Zhang en Weinberg, 2018). Recent is aangetoond dat UBR5 een zeer belangrijke factor is in IFN-γ-geïnduceerde PDL1-transcriptie in TNBC vanwege het ontbreken van E3-ubiquitinatieactiviteit. RNA-transcriptoomanalyse onthulde dat UBR5 systemische effecten kan hebben op genen die geassocieerd zijn met de IFN-γ-route en PDL1-transactivatie kan bevorderen door de activatieniveaus van proteïnekinase-RNA-RNA (PKR) en de bijbehorende signaaltransducers en activatoren, zoals STAT1 en interferon-regulerende factor 1 (IRF1), te verhogen. De gecombineerde ablatie van UBR5- en PD-L1-expressie met behulp van CRISPR/Cas9 heeft echter een synergetisch therapeutisch effect ten opzichte van blokkade van elk van beide afzonderlijk, met diepgaande gevolgen voor het tumormicro-omgeving (Wu et al., 2022). CRISPR/Cas9 zou daarom een belangrijk instrument kunnen zijn om de UBR5-functie te remmen en zo de metastase en tumorgroei van TNBC te onderdrukken.
ROR1 is een type I transmembraanproteïne dat tot expressie komt tijdens kanker en embryonale ontwikkeling en is geïdentificeerd als een oncofetaal proteïne (Nicholas Borcherding, 2014). Het invasieve gedrag van verschillende menselijke kankers wordt geassocieerd met een verhoogde expressie van ROR1. veelbelovende resultaten zijn verkregen uit in vivo en in vitro studies met therapeutische verbindingen die gericht zijn op ROR1 (Chien et al., 2016). Verhoogde niveaus van ROR1 mRNA in borstweefselbiopsieën zijn ook geassocieerd met agressieve basaalcelachtige borsttumoren (BL-tumoren) en hun migratie naar andere delen van het lichaam. Bovendien is overexpressie van ROR1 geïdentificeerd als een prognostische marker voor de ontwikkeling van TNBC (Chien et al., 2016). Het uitschakelen van ROR1 met behulp van CRISPR/Cas9 om de groei en metastase van TNBC te onderdrukken zou echter een effectieve strategie zijn.
Het sialyleringsproces omvat de toevoeging van siaalzuur aan glycoconjugaten, wat wordt gekatalyseerd door sialyltransferasen (ST's). ST8SIA1 behoort tot de ST-familie en speelt een belangrijke rol in de pathogenese van verschillende ziekten, zoals lymfatische leukemie en colorectale kanker (Chang et al., 2018). RNA-sequentieanalyse toont aan dat ST8SIA1 sterk tot expressie komt in borstweefsel van TNBC-patiënten en positief gecorreleerd is met mutaties in het tumorsuppressorgen p53, wat mogelijk bijdraagt aan de pathogenese van TNBC (Battula et al., 2017). Bovendien is ST8SIA1 betrokken bij de metastase en recidief van TNBC, wat suggereert dat het een belangrijke rol speelt bij het ontstaan en de ontwikkeling van TNBC. In een in vitro-model van TNBC is aangetoond dat het uitschakelen van ST8SIA1 met CRISPR/Cas9 de groei en metastase blokkeert (Battula et al., 2017). Dit suggereert dat CRISPR/Cas9 een belangrijk hulpmiddel kan zijn voor het remmen van de functie van het ST8SIA1-oncogen bij de behandeling van TNBC.
NAT1 is een metabolisch enzym dat de vorming van fase II xenobiotische verbindingen katalyseert en in vrijwel alle menselijke weefsels tot expressie komt. NAT1 kan de cofactor folaat gebruiken om acetyl-CoA (acetyl-CoA) te targeten, zelfs in afwezigheid van het aromatische aminesubstraat (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Studies hebben aangetoond dat NAT1 de functie van matrixmetalloproteïnase 9 (MMP9) reguleert in borstkankercelmodellen en beschermt tegen reactieve zuurstofsoorten (ROS) tijdens glucosegebrek (Wang et al., 2018). Het is aangetoond dat deletie van NAT1 het pyruvaatdehydrogenasecomplex remt, wat leidt tot mitochondriale disfunctie (Wang L. et al., 2019). Daarnaast hebben diverse andere onderzoeken aangetoond dat remming van NAT1 met behulp van kleine moleculen en siRNA-silencing de invasiviteit en proliferatie van borstkankercellen kan verminderen (Stepp et al., 2018). Recentelijk werd CRISPR/Cas9 gebruikt om NAT1 te onderdrukken in de borstkankercellijn MDA-MB-231, waarbij het cellulaire metabolisme werd beïnvloed afhankelijk van het expressieniveau. Deze studie toonde ook aan dat NAT-1 cruciaal is voor de progressie en metastase van TNBC (Carlisle et al., 2020).
Gecoördineerde transcriptie van oncogenen wordt gereguleerd door super-enhancers, transcriptiefactoren en cofactoren (Hnisz et al., 2015). Daarnaast is een groep cycline-afhankelijke kinasen (CDK's), zoals CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 en CDK13, nodig voor transcriptieregulatie. CDK7 is onder andere betrokken bij de fosforylering van RNA-polymerase II, wat zeer belangrijk is voor de initiatie en uitbreiding van oncogentranscriptie in de pathogenese van TNBC. In een baanbrekende studie remde deletie van CDK7 met CRISPR/Cas9 de groei van TNBC, wat aangeeft dat de pathogenese van TNBC CDK7-afhankelijk is (Wang Y. et al., 2015).
Studies hebben aangetoond dat mutaties in MYC en RBP (RNA-bindend eiwit) kunnen leiden tot apoptose, terwijl mutaties in één enkel gen, MYC of RBP, de groei van kankercellen niet beïnvloeden (Einstein et al., 2021). Meer dan 1000 RBP's in het menselijk genoom zijn gescreend met behulp van een CRISPR/Cas9-bibliotheek. Daarvan bleken 57 RBP's cruciaal te zijn voor de groei van kankercellen met sterk verhoogde MYC-niveaus (Wheeler et al., 2020). Bovendien is YTHDF2 belangrijk voor het in stand houden van de groei van TNBC-cellen en vermindert het de hoeveelheid gemethyleerde transcripten tijdens transcriptie en translatie op hoog niveau in kankercellen met een hogere MYC-expressie. YTHDF2 is echter niet essentieel voor kankercellen die minder afhankelijk zijn van verhoogde MYC-niveaus om de overleving van TNBC-patiënten te verlengen (Einstein et al., 2021), wat suggereert dat het een potentieel therapeutisch doelwit kan zijn voor geneesmiddelen die TNBC kunnen bestrijden.
Zinkvingerproteïnen (ZNF's) maken ongeveer 1% van het totale menselijke genoom uit. Studies hebben aangetoond dat ZNF de celproliferatie in verschillende kankersoorten kan reguleren, zoals leverkanker, borstkanker en darmkanker (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Bibliotheken die zijn gegenereerd door CRISPR-knockout zijn gebruikt om verschillende tumorsuppressorgenen (TSG's) in borstkankercellen te screenen (Shalem et al., 2014). Sindsdien heeft een transcriptomische studie van met CRISPR/Cas9 ZNF319-verwijderde borstkankercellen aangetoond dat ZNF319 een tumorsuppressorgen is dat de proliferatie van borstkanker remt en daarom betrokken is bij verschillende potentiële signaalmechanismen en andere biologische functies (Wang L. et al., 2022).
Ferroptose is een vorm van geprogrammeerde celdood die afhankelijk is van de aanwezigheid van ijzer. Het is bekend dat de ontwikkeling van ferroptose wordt beïnvloed door de aanwezigheid van lipideperoxiden. Bovendien is gerapporteerd dat PKCβII vroege lipideperoxidatie vertoont, en verhoogde lipideperoxidatie wordt geassocieerd met ferroptose. Screening van een bibliotheek met CRISPR/Cas9-gemedieerde kinase-remmers bracht aan het licht dat PKCβII betrokken is bij het proces van lipideperoxidatie, wat cruciaal is voor ferroptose in MDA-MB-231-cellen (Zhang et al., 2022). Dit suggereert daarom dat het uitschakelen van PKCβII met CRISPR/Cas9 een potentieel doelwit voor tumorsuppressorgenen kan zijn voor de behandeling van ferroptose-gerelateerde ziekten (Zhang et al., 2022).
Geneesmiddelresistentie is naar schatting verantwoordelijk voor ongeveer 90% van de sterfgevallen bij kankerpatiënten en vormt een van de grootste uitdagingen in de kankerbehandeling (Bukowski et al., 2020). Uit onderzoek blijkt dat een aanzienlijk aantal genen gerelateerd aan geneesmiddeluitstroom, DNA-reparatie, apoptose en diverse cellulaire signaalroutes geassocieerd zijn met geneesmiddelresistentie (Haider et al., 2020). Verschillende van deze genen zijn aangepakt met CRISPR/Cas9-technieken en hebben veelbelovende resultaten laten zien in het verminderen van geneesmiddelresistentie en het verhogen van de effectiviteit van kankerbehandelingen (Vaghari-Tabari et al., 2022). Daarnaast zijn high-throughput CRISPR/Cas9-gen-knockout-screeningbibliotheken ingezet om de functie van potentiële doelwitten voor geneesmiddelresistentiegenen te modificeren (Shalem et al., 2015). Om genen te identificeren die resistentie tegen paclitaxel veroorzaken, werd RNA-sequencing in combinatie met een genoombrede screening van een sgRNA-bibliotheek gebruikt om acht kandidaatgenen te identificeren, waaronder histone deacetylase 9 (HDAC9), die geassocieerd zijn met geneesmiddelresistentie bij patiënten met recidiverende TNBC (B et al., 2020). In een andere studie werd een verhoogde expressie van diserine/threonine en tyrosine proteïnekinase (DSTYK) waargenomen tijdens de overleving van TNBC-patiënten die met antikankermedicijnen werden behandeld. Bovendien verbeterde CRISPR/Cas9-gemedieerde knockdown van DSTYK de apoptose van geneesmiddelresistente kankercellen in vitro (SUM102PT-cellen en MDA-MB-468-cellen) en in een in vivo TNBC-model aanzienlijk (Ogbu et al., 2021).
Hoewel TNBC een abnormale activering van de MAPK-route vertoont, is het klinische effect van MEK-gerichte therapieën gering. Een CRISPR/Cas9-genomische bibliotheekscreening toonde aan dat remming van PSMG2 (proteoomassemblage-chaperone 2) TNBC BT549- en MB468-cellen gevoeliger maakt voor de MEK-remmer AZD6244. CRISPR/Cas9-knockdown van PSMG2 verstoorde de normale proteasoomfunctie, wat leidde tot autofagie-gemedieerde afbraak van PDPK1, waardoor de tumorcellen in TNBC-muismodellen, geïnduceerd door AZD6244 (MEK-remmer) en MG132 (proteasoomremmer), verder verbeterden. Proteasoom- en MAP-kinase (MEK)-remmers kunnen dus synergetisch worden toegediend om de proliferatie van tumorcellen te verminderen (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 is ook gebruikt om te screenen op verlies van genfunctie dat leidt tot TNBC-resistentie (Shu et al., 2020). Ge et al. beschreven het mechanisme van geneesmiddelresistentie van kankercellen behandeld met JQ1, een BET-bromodomeinremmer (BBDI), bij TNBC. Met behulp van CRISPR/Cas9 ontdekten ze dat het verwijderen van het rb1-gen ervoor zorgde dat TNBC resistent werd tegen het antikankermiddel JQ1. De functie van rb1 is dus belangrijk voor de respons op JQ1-medicijnen bij TNBC. Ze rapporteerden ook dat paclitaxel een CDK4/6-kinase/microtubule-remmer is en dat de combinatie ervan met BBDI's zoals JQ1 veelbelovende therapeutische resultaten kan opleveren bij geneesmiddelresistente TNBC (Ge et al., 2020).
Er is gerapporteerd dat het transcriptiepatroon van lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) verantwoordelijk is voor resistentie tegen neoadjuvante therapie bij TNBC. Deze studie toont aan dat vijf verschillende MALAT1 lncRNA-transcripten sterk tot expressie komen in TNBC. Bovendien verhoogde CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie van MALAT1 de gevoeligheid van TNBC BT-549-cellen voor paclitaxel en doxorubicine, wat suggereert dat MALAT1-resistentie mogelijk een rol speelt bij TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutaties in BRCA1 (BRCA1m) zijn heterogeen en daardoor moeilijk te detecteren. Het richten op PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase), de synthetisch letale partner van BRCA1, kan de chemosensitiviteit van TNBC-cellen voor geneesmiddelen verhogen. Met behulp van CRISPR/Cas9 verhoogde deletie van PARP1 de gevoeligheid van antikankermiddelen zoals doxorubicine, gemcitabine en docetaxel voor mBRCA1-mutante TNBC-cellen, wat suggereert dat PARP1 ook betrokken is bij geneesmiddelresistentie in TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutaties in de tumorsuppressorgenen BRCA1 of BRCA2 staan erom bekend de kans op het ontwikkelen van borstkanker te vergroten. De behandeling van deze patiënten vereist het gebruik van PARP-remmers. Bovendien is aangetoond dat het uitschakelen van de nucleotide-salvagefactor DNPH1 met behulp van CRISPR/Cas9 het toxische nucleotide 5-hydroxymethyldeoxyuridine (hmdU) monofosfaat kan verwijderen, waardoor de respons van BRCA-deficiënte cellen op de gevoeligheid voor PARP-remmers wordt verbeterd (Fugger et al., 2021). CRISPR/Cas9 en PARP1-remmers zouden daarom een belangrijke behandelingsstrategie voor TNBC kunnen worden.
Het gen voor penetrant glycoproteïne (P-gp) is een gen voor multiresistentie tegen geneesmiddelen dat over het algemeen verhoogd tot expressie komt in ongeveer 41% van alle TNBC-gevallen (Sun et al., 2020). P-gp-geïnduceerde geneesmiddeluitstroom is geïdentificeerd als een belangrijke regulator van geneesmiddelresistentie bij borstkanker. P-gp-remmers hebben aangetoond dat ze de gevoeligheid voor antikankermedicijnen bij borstkanker verhogen (Famta et al., 2021). Daarom kunnen CRISPR/Cas9-gemedieerde ablatie of onderdrukking van P-gp en P-gp-remmers zeer belangrijke methoden zijn om geneesmiddelresistentie bij TNBC te overwinnen.
Het is bekend dat ATP-bindende cassette-transporter G2 (ABCG2) geneesmiddelresistentie veroorzaakt bij TNBC (Palasuberniam et al., 2015), hoewel er momenteel geen rapporten zijn over de relatie tussen CRISPR/Cas9 en ABCG2-silencing en de inactivatie van tumorsuppressorgenen. PTEN kan de ABCG2-activering versterken (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Daarom zou het gebruik van CRISPR/Cas9 om ABCG2 te verwijderen en dit te combineren met een ABCG2-remmer een geschikte behandeling kunnen zijn om geneesmiddelresistentie bij TNBC te overwinnen. Tabel 2 toont alle CRISPR/Cas9-targets voor resistentiegenen.
Tabel 2. CRISPR/Cas9 richt zich op verschillende TNBC-resistentiegenen om cellen gevoeliger te maken voor geneesmiddelen tegen kanker.
CRISPR/Cas9-bibliotheken zijn potentiële hulpmiddelen voor het screenen op genmutaties die verband houden met de pathogenese van kanker (Chan et al., 2022). Deze screeningsmethode omvat vier stappen: (a) bibliotheekconstructie, (b) lentivirale transductie, (c) fenotypische screening en (d) analyse van het doelgen. Hoewel TNBC een abnormale activering van de MAPK-route vertoont, is de klinische prognose van MEK-gerichte therapie voor TNBC-patiënten met mutaties in tumorsuppressorgenen zoals PTEN, RB1 en TP53 zeer slecht.
Daarnaast werd met behulp van een CRISPR/Cas9-gen-knockoutscreening het meest potente en selectieve molecuul, dehydrocatrol, getest. Dit molecuul komt veel voor in Guatemalteekse bloem- en bladextracten, en het doel was om het effect van dehydrocatrol op MDA-MB-231-cellen te onderzoeken. Mechanismen van selectieve celcytotoxiciteit. Mesenchymale stamcelkenmerken van TNBC-subtypen. Deze CRISPR/Cas9-screening bracht ook aan het licht dat HSD17B11, een gen dat codeert voor 17β-hydroxysteroïde dehydrogenase type 11, sterk tot expressie komt in MDA-MB-231-cellen en resulteert in dehydrofalcarinol dat specifiek is voor MDA-MB-231-cellen (Grant et al., 2020). Dit suggereert dat CRISPR/Cas9-genomische screening een groot potentieel heeft voor het identificeren van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de antikankereigenschappen van potentiële natuurlijke verbindingen.
Daarnaast werd de kwetsbaarheid van TNBC voor kanker onderzocht met behulp van een onbevooroordeelde, genoombrede in vivo CRISPR/Cas9-screening, die een verband aantoonde tussen oncogene en tumorsuppressieve pathways. Er is gerapporteerd dat belangrijke componenten van de mTOR- en Hippo-pathways een belangrijke rol spelen in de tumorregulatie bij TNBC. Bovendien hebben studies aangetoond dat farmacologische remming van mTORC1/2 en het YAP-oncoproteïne de pathogeniciteit van TNBC effectief remt, zowel met behulp van een in vitro geneesmiddel-matrix-synergiemodel als met in vivo patiëntafgeleide xenografts. Verder bevordert Torin-1-gemedieerde mTORC1/2-remming macropinocytose, terwijl verteporfin-geïnduceerde YAP-remming leidt tot celdood bij TNBC. Al met al benadrukken deze resultaten de kracht en robuustheid van genoombrede in vivo CRISPR-screening voor het identificeren van nieuwe en effectieve behandelingen voor TNBC (Dai et al., 2021).
Een ontregeling van het immuunsysteem is een belangrijke factor bij de ontwikkeling van tumoren. Kankercellen ontwijken immuunafweer door afweermechanismen te omzeilen, waaronder het verstoren van de activiteit van immuuncellen in de tumoromgeving en het ondermijnen van het immuunsysteem. Het ontwikkelen van een verbeterd immuunsysteem kan daarom een cruciale aanpak zijn in de strijd tegen tumoren. Het gebruik van CRISPR/Cas9-gebaseerde genmodificatie pakt verschillende problemen met betrekking tot immuundysfunctie vanuit verschillende perspectieven aan. CRISPR/Cas9 is gebruikt om de antitumorale immuniteit tegen borstkanker te verbeteren via de volgende mechanismen (Figuur 3).
Figuur 3. CRISPR/Cas9-immunotherapie richt zich op TNBC-cellen. Verlies van CDK5 en knockdown van PDL1 en CD155 versterken het immuunsysteem. Evenzo verhoogden verlies van A2AR en knockdown van TAA's zoals HER2, mucine 1 en TEM8 de efficiëntie van CAR-T-cellen bij het doden van kankercellen. CRISPR/Cas9-gestuurde T-celscreening heeft aangetoond dat verstoring van p38-kinase de antitumoractiviteit van T-cellen versterkt. T-cellen gemodificeerd met CRISPR/Cas9 verhogen de expressie van TCR (T-celreceptor), wat resulteert in T-cellen met antitumoractiviteit.
Het doel van immunotherapie is het immuunsysteem te stimuleren om kankercellen aan te vallen. Overexpressie van immuuncheckpointproteïnen voorkomt meestal auto-immuunreacties, maar kan kankercellen helpen deze te vermijden (Topalian et al., 2015). Deze proteïnen voorkomen immuunreacties door zich te binden aan receptoren op het oppervlak van immuuncellen. Verschillende checkpointproteïnen (zoals CD155 en PD-L1) richten zich op de PD-1-receptor op immuuncellen en worden tot expressie gebracht in borstkanker, met name TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Het uitschakelen van PD-L1 of de bijbehorende receptor met behulp van CRISPR/Cas9 kan het immuunsysteem stimuleren om TNBC-tumoren aan te vallen (Yahata et al., 2019). Bovendien is aangetoond dat downregulatie van de PD-L1-expressie door middel van CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie van CDK5 de tumorgroei in vitro en in vivo remt (Deng et al., 2020). Groeiremming in in vitro en in vivo modellen van borstkanker suggereert dat shRNA-gemedieerde reductie van CD155 een therapeutisch effect kan hebben op borstkanker (Gao et al., 2018).
CAR T-cellen brengen CAR's tot expressie die tumor-geassocieerde antigenen (TAA's) herkennen en kunnen gebruikmaken van knockdown van checkpoint-eiwitten om hun activiteit te versterken (Li C. et al., 2020). Er zijn verschillende potentiële targets voor CAR T-celtherapie bij borstkanker, waaronder diverse TAA's zoals HER2, mucine 1 en TEM8 (Bajgain et al., 2018). Er is bewijs dat CAR T-cellen die zich richten op mesotheline (overgeëxpresseerd in TNBC BT-459-cellen) effectiever zijn tegen kanker wanneer PD-1 wordt uitgeschakeld met behulp van CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Het isoleren van T-cellen van patiënten en deze vervolgens ex vivo bewerken is echter een arbeidsintensief en tijdrovend proces. Hoewel universele T-cellen de isolatievereisten kunnen verminderen, moeten donor-T-cellen die humaan leukocytenantigeen (HLA) klasse I en T-celreceptor (TCR) tot expressie brengen, worden verwijderd om graft-versus-host-afwijkingen te voorkomen (Ren et al., 2017a). Met behulp van CRISPR/Cas9 kan HDR tegelijkertijd TCR en HLA elimineren en het gen dat codeert voor CAR uitschakelen. Studies hebben aangetoond dat CRISPR/Cas9 kan worden gebruikt om anti-CD19 CAR's in het TCR-locus te introduceren, waardoor efficiënt CAR's worden geproduceerd zonder T-cellen te depleteren (Dimitri et al., 2022). Multiplextechnologieën zijn ontwikkeld om allogene CAR T-cellen te genereren door tegelijkertijd TCR, bèta-2-microglobuline (B2M), HLA-I-subeenheid en andere eiwitten zoals PD-1 en CTLA-4 te elimineren, wat mogelijk grotere antikankereigenschappen oplevert. tegen TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Het gebruik van CRISPR/Cas9 zou de effectiviteit van CAR-T-cellen kunnen verbeteren. Van adenosine is bekend dat het immunosuppressieve eigenschappen heeft en de antitumorale immuniteit kan verminderen door de T-celfunctie te blokkeren en adenosine A2A-receptoren (A2AR) te activeren (Vigano et al., 2019). Het uitschakelen van A2AR met behulp van CRISPR/Cas9 verbeterde de werkzaamheid van CAR-T-cellen in vivo aanzienlijk (Giuffrida et al., 2021). T-cellen vertonen diverse fenotypische kenmerken, zoals celgroei, differentiatie, oxidatieve stress en genomische stress. CRISPR/Cas9-gebaseerde T-celscreening bracht verstoringen aan het licht van 25 verschillende T-celreceptorkinasen. Onder deze kinasen is aangetoond dat deletie van p38-kinase de antitumoractiviteit van T-cellen versterkt, wat aangeeft dat p38-kinase een belangrijke regulator is van CAR-T-celregulatie (Gurusamy et al., 2020).
T-cellen kunnen genetisch gemodificeerd worden met behulp van CRISPR/Cas9 om sterk tot expressie gebrachte TCR's te produceren. De overdracht van genetisch gemodificeerde T-cellen naar patiënten heeft een sterkere antitumoractiviteit laten zien dan endogene T-cellen. Endogene TCR's kunnen dus concurreren met genetisch gemodificeerde TCR's bij patiënten, wat de potentie van kankerimmunotherapie kan beïnvloeden. Om dit probleem te ondervangen, kan het gebruik van CRISPR/Cas9 om endogene TCR-β in ontvangende cellen te verwijderen en vervolgens TCR-β T-cellen over te dragen aan kankerpatiënten betere antitumorale immuunresponsen opleveren zonder dat er sprake hoeft te zijn van endogene TCR-competitie (Fan et al. 2018). Met uitzondering van CRISPR-gemodificeerde T-cellen zijn TCR's dus duizend keer gevoeliger voor tumorantigenen dan normale TCR-getransduceerde T-cellen. Bovendien vertonen gemodificeerde T-cellen, gegenereerd door γδ TCR+ CRISPR, bij verschillende vormen van leukemie een hogere expressie van CD4+ en CD8+ T-cellen dan standaard TCR-overdracht (Legut et al., 2018). Gemodificeerde T-cellen, gegenereerd met behulp van CRISPR/Cas9, zouden dus een effectieve immunotherapiemethode kunnen zijn om TNBC te bestrijden.
Integrinen zijn celadhesiemoleculen die aanwezig zijn in cellulaire transmembranen en de binding van cellen aan de extracellulaire matrix (ECM) bevorderen (Hamidi en Ivaska, 2018). Dysregulatie van integrinen wordt geassocieerd met de ontwikkeling en migratie van kanker door de extracellulaire matrix te veranderen, wat leidt tot overleving van kankercellen in de bloedsomloop (Hamidi en Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-gemedieerde integrine-knockdown vertraagt de tumorprogressie, metastase en kolonisatie bij TNBC. Knockdown van integrine α5 (ITGA5) blijkt de celmigratie en -progressie te verminderen bij andere kankersoorten, zoals longkanker (Ju et al., 2017), wat suggereert dat integrine α5 mogelijk ook een belangrijke factor is in de pathogenese van TNBC.
Het genereren van knock-outmuizen met behulp van traditionele methoden met embryonale stamcellen (ES-cellen) is een arbeidsintensief, tijdrovend en inefficiënt proces. Het duurt maanden en jaren om ES-cellen te modificeren via homologe recombinatie, chimere muizen te fokken en deze vervolgens te kruisen met heterozygote muizen om homozygote nakomelingen te produceren. Complexe kruisingen zijn nodig om muizen met meerdere genetische mutaties te creëren. Er zijn echter veel problemen ontstaan bij het gebruik van muizen die zijn gegenereerd door ablatie van ES-cellen met behulp van CRISPR/Cas9 of door micro-injectie van CRISPR/Cas9-componenten in bevruchte eicellen met één cel. Zo vindt de introductie van veranderingen vaak plaats op biallele loci en is deze niet genspecifiek. Recent werd gerapporteerd dat ES-cellen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie tegelijkertijd biallele mutaties in maximaal 5 genen kunnen inbrengen (Nishizono et al., 2021). Hiervoor werden Cas9-mRNA en vijf genspecifieke gRNA's tegelijkertijd getransfecteerd in ES-cellen. Dit benadrukt de belofte en effectiviteit van deze procedure, hoewel deze mutaties mogelijk zijn doorgegeven toen stamlijnen werden gefokt om vijfvoudige knock-outmuizen te produceren. De studie rapporteert ook een verrassende ontdekking: ES-cellen zijn niet langer nodig om genetisch gemodificeerde muizen te creëren. In plaats daarvan werden Cas9 mRNA en gRNA geïnjecteerd in embryo's in het eencellige stadium om specifieke genproducten te verwijderen. Als gevolg hiervan zijn knock-outstamlijnen gecreëerd die theoretisch gebruikt kunnen worden om de gevolgen van genverwijdering bij muizen te bestuderen (Qin et al., 2016). CRISPR/Cas9 maakt het dus mogelijk om transgene muizen te creëren voor de behandeling van TNBC tegen lagere kosten dan traditionele genetische manipulatie. Met behulp van het CRISPR/Cas-systeem is een nieuw knock-outmuismodel ontwikkeld dat met succes puntmutaties kan introduceren in een of meer endogene genen bij TNBC. Op basis van dit concept kunnen ook diermodellen van TNBC worden ontwikkeld met behulp van CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie van BRCA1 en p53, wat resulteert in verlies van HR-reparatie, genomische instabiliteit en mutante fenotypes (Annunziato et al., 2020).
Momenteel worden verschillende methoden, zoals mammografie, magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) en echografie, gebruikt om TNBC te diagnosticeren. Deze methoden hebben echter enkele beperkingen. Mammografie wordt gebruikt om lokaal borstweefsel te diagnosticeren en niet metastasen, waarbij kankercellen zich naar andere organen hebben verspreid. Echografie is geen betrouwbare methode voor de diagnose van TNBC (Chen en Lee-Felker, 2023). MRI heeft een hogere gevoeligheid dan echografie en mammografie, maar de diagnostische nauwkeurigheid is beperkt (Sha en Chen, 2022). Weefselbiopsie is een invasieve manier om kankercellen te identificeren. In sommige gevallen kan een biopsie echter kankerweefsel missen als de naald buiten het te onderzoeken gebied terechtkomt. Bovendien is het erg duur en kan het traumatisch zijn voor de patiënt. TNBC is een heterogene vorm van kanker, waardoor een biopsie mogelijk onvoldoende informatie geeft over het type kanker. Daarom is er dringend behoefte aan een nieuwe, diagnostisch betrouwbare methode voor het opsporen van TNBC. CRISPR/Cas9 kan dienen als een zeer gevoelig en minimaal invasief alternatief voor de diagnose van borstkanker. CRISPR/Cas9-gebaseerde strategieën kunnen worden gebruikt om PCR-methoden voor de diagnose van triple-negatieve borstkanker (TNBC) te verbeteren. Eerst worden de Cas9- en cpf1-eiwitten van het CRISPR-systeem gebruikt om niet-specifiek DNA te verwijderen, waarna deze twee eiwitten (Cas9 en cpf1) de PAM-sequentie herkennen voordat ze zich binden aan het doel-DNA (Deepak Singh et al., 2021). Op deze manier kan PCR mutaties identificeren die verband houden met de ontwikkeling van kanker. Verschillende studies hebben deze CRISPR-gebaseerde strategie toegepast om verschillende mutaties in verschillende kankersoorten op te sporen (Safari et al., 2019). CRISPR-gebaseerde PCR-methoden kunnen de afhankelijkheid van invasieve methoden, zoals immunohistochemie op basis van biopsie, voor de diagnose van TNBC verminderen.
Ook zijn er genotypische veranderingen in de regulatie van hormoonreceptoren aangetoond bij TNBC (Chen en Russo, 2009). CRISPR/Cas9-gebaseerde PCR-strategieën met behulp van microarrays voor diagnostiek op de plaats van zorg kunnen deze mutaties effectief monitoren (Hajian et al., 2019). Dit kan zorgverleners ook relevante informatie verschaffen over specifieke mutaties bij TNBC-patiënten, wat kan bijdragen aan een betere behandeling. Deze gecombineerde techniek kent echter beperkingen. Daarom is uitgebreid onderzoek nodig voordat deze CRISPR/Cas-PCR-methode in de gezondheidszorg kan worden gebruikt voor de diagnose van TNBC (Yang et al., 2019).
Geplaatst op: 14 oktober 2024