Differentiële diagnose van longknobbeltjes geïdentificeerd door computertomografie (CT) blijft een uitdaging in de klinische praktijk.Hier karakteriseren we het globale metaboloom van 480 serummonsters, waaronder gezonde controles, goedaardige longknobbeltjes en stadium I longadenocarcinoom.Adenocarcinomen vertonen unieke metabolomische profielen, terwijl goedaardige knobbeltjes en gezonde individuen een grote gelijkenis vertonen in metabolomische profielen.In de ontdekkingsgroep (n = 306) werd een reeks van 27 metabolieten geïdentificeerd om onderscheid te maken tussen goedaardige en kwaadaardige knobbeltjes.De AUC van het discriminantmodel in de groepen met interne validatie (n = 104) en externe validatie (n = 111) was respectievelijk 0,915 en 0,945.Pathway-analyse onthulde verhoogde glycolytische metabolieten geassocieerd met verlaagd tryptofaan in longadenocarcinoomserum vergeleken met goedaardige knobbeltjes en gezonde controles, en suggereerde dat de opname van tryptofaan de glycolyse in longkankercellen bevordert.Onze studie benadrukt de waarde van serummetabolietbiomarkers bij het beoordelen van het risico op longknobbeltjes gedetecteerd door CT.
Vroegtijdige diagnose is van cruciaal belang om de overlevingskansen van kankerpatiënten te verbeteren.Resultaten van de Amerikaanse National Lung Cancer Screening Trial (NLST) en de Europese NELSON Study hebben aangetoond dat screening met lage dosis computertomografie (LDCT) de sterfte aan longkanker in risicogroepen aanzienlijk kan verminderen1,2,3.Sinds het wijdverbreide gebruik van LDCT voor screening op longkanker is de incidentie van incidentele radiografische bevindingen van asymptomatische longknobbeltjes blijven toenemen 4 .Longknobbeltjes worden gedefinieerd als focale opaciteiten met een diameter tot 3 cm 5 .We worden geconfronteerd met moeilijkheden bij het beoordelen van de waarschijnlijkheid van een maligniteit en bij het omgaan met het grote aantal longknobbeltjes dat incidenteel bij LDCT wordt gedetecteerd.Beperkingen van CT kunnen leiden tot frequente vervolgonderzoeken en vals-positieve resultaten, wat leidt tot onnodige interventie en overbehandeling6.Daarom is er behoefte aan het ontwikkelen van betrouwbare en bruikbare biomarkers om longkanker in de vroege stadia correct te identificeren en de meeste goedaardige knobbeltjes bij de eerste detectie te differentiëren 7 .
Uitgebreide moleculaire analyse van bloed (serum, plasma, mononucleaire cellen uit perifeer bloed), inclusief genomica, proteomics of DNA-methylatie8,9,10, heeft geleid tot een groeiende belangstelling voor de ontdekking van diagnostische biomarkers voor longkanker.Ondertussen meten metabolomics-benaderingen cellulaire eindproducten die worden beïnvloed door endogene en exogene acties en worden daarom toegepast om het begin en de uitkomst van ziekten te voorspellen.Vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie (LC-MS) is een veelgebruikte methode voor metabolomics-studies vanwege de hoge gevoeligheid en het grote dynamische bereik, dat metabolieten met verschillende fysisch-chemische eigenschappen kan omvatten11,12,13.Hoewel globale metabolomische analyse van plasma/serum is gebruikt om biomarkers te identificeren die geassocieerd zijn met de diagnose van longkanker14,15,16,17 en de werkzaamheid van de behandeling,18 moeten de classificatoren van serummetabolieten om onderscheid te maken tussen goedaardige en kwaadaardige longknobbeltjes nog veel bestudeerd worden.-grootschalig onderzoek.
Adenocarcinoom en plaveiselcelcarcinoom zijn de twee belangrijkste subtypes van niet-kleincellige longkanker (NSCLC).Verschillende CT-screeningstests geven aan dat adenocarcinoom het meest voorkomende histologische type longkanker is1,19,20,21.In deze studie hebben we ultra-performance vloeistofchromatografie-hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gebruikt om metabolomics-analyses uit te voeren op in totaal 695 serummonsters, inclusief gezonde controles, goedaardige longknobbels en CT-gedetecteerd ≤3 cm.Screening op stadium I longadenocarcinoom.We identificeerden een panel van serummetabolieten die longadenocarcinoom onderscheiden van goedaardige knobbeltjes en gezonde controles.Pathway-verrijkingsanalyse onthulde dat abnormaal tryptofaan- en glucosemetabolisme vaak voorkomende veranderingen zijn bij longadenocarcinoom in vergelijking met goedaardige knobbeltjes en gezonde controles.Ten slotte hebben we een serummetabolische classificator met hoge specificiteit en gevoeligheid vastgesteld en gevalideerd om onderscheid te maken tussen kwaadaardige en goedaardige longknobbeltjes gedetecteerd door LDCT, wat kan helpen bij vroege differentiële diagnose en risicobeoordeling.
In de huidige studie werden retrospectief op geslacht en leeftijd afgestemde serummonsters verzameld van 174 gezonde controles, 292 patiënten met goedaardige longknobbeltjes en 229 patiënten met stadium I longadenocarcinoom.Demografische kenmerken van de 695 proefpersonen worden weergegeven in aanvullende tabel 1.
Zoals weergegeven in Figuur la werden in totaal 480 serummonsters, waaronder 174 gezonde controle (HC), 170 goedaardige knobbeltjes (BN) en 136 stadium I longadenocarcinoom (LA) monsters, verzameld bij het Sun Yat-sen University Cancer Center.Ontdekkingscohort voor ongerichte metabolomische profilering met behulp van ultra-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie met hoge resolutie (UPLC-HRMS).Zoals weergegeven in aanvullende figuur 1 werden differentiële metabolieten tussen LA en HC, LA en BN geïdentificeerd om een classificatiemodel op te stellen en de differentiële routeanalyse verder te onderzoeken.104 monsters verzameld door het Sun Yat-sen University Cancer Center en 111 monsters verzameld door twee andere ziekenhuizen werden respectievelijk onderworpen aan interne en externe validatie.
een onderzoekspopulatie in het ontdekkingscohort dat een wereldwijde analyse van serummetabolomics onderging met behulp van ultra-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie met hoge resolutie (UPLC-HRMS).b Gedeeltelijke analyse van de kleinste kwadratendiscriminant (PLS-DA) van het totale metaboloom van 480 serummonsters uit het onderzoekscohort, inclusief gezonde controles (HC, n = 174), goedaardige knobbeltjes (BN, n = 170) en stadium I longadenocarcinoom (Los Angeles, n = 136).+ESI, positieve elektrospray-ionisatiemodus, -ESI, negatieve elektrospray-ionisatiemodus.c – e Metabolieten met significant verschillende hoeveelheden in twee gegeven groepen (tweezijdige Wilcoxon ondertekende rangtest, aangepaste p-waarde voor valse ontdekkingen, FDR <0,05) worden weergegeven in rood (voudige verandering> 1,2) en blauw (voudige verandering <0,83) .) weergegeven op de vulkaanafbeelding.f Hiërarchische clustering-hittekaart die significante verschillen laat zien in het aantal geannoteerde metabolieten tussen LA en BN.Brongegevens worden aangeleverd in de vorm van brongegevensbestanden.
Het totale serummetaboloom van 174 HC, 170 BN en 136 LA in de ontdekkingsgroep werd geanalyseerd met behulp van UPLC-HRMS-analyse.We laten eerst zien dat kwaliteitscontrolemonsters (QC) strak in het centrum van een onbewaakt hoofdcomponentenanalysemodel (PCA) clusteren, wat de stabiliteit van de prestaties van het huidige onderzoek bevestigt (aanvullende figuur 2).
Zoals blijkt uit de gedeeltelijke kleinste kwadraten-discriminantanalyse (PLS-DA) in figuur 1b, ontdekten we dat er duidelijke verschillen waren tussen LA en BN, LA en HC in positieve (+ESI) en negatieve (−ESI) elektrospray-ionisatiemodi. .geïsoleerd.Er werden echter geen significante verschillen gevonden tussen BN en HC in +ESI- en -ESI-omstandigheden.
We hebben 382 differentiële kenmerken gevonden tussen LA en HC, 231 differentiële kenmerken tussen LA en BN, en 95 differentiële kenmerken tussen BN en HC (Wilcoxon Signed Rank Test, FDR <0,05 en meervoudige verandering >1,2 of <0,83) (Figuur .1c-e )..Pieken werden verder geannoteerd (aanvullende gegevens 3) tegen een database (mzCloud/HMDB/Chemspider-bibliotheek) op basis van m/z-waarde, retentietijd en fragmentatie-massaspectrumonderzoek (details beschreven in de sectie Methoden) 22 .Ten slotte werden 33 en 38 geannoteerde metabolieten met significante verschillen in overvloed geïdentificeerd voor respectievelijk LA versus BN (Figuur 1f en aanvullende tabel 2) en LA versus HC (aanvullende figuur 3 en aanvullende tabel 2).Daarentegen werden slechts 3 metabolieten met significante verschillen in overvloed geïdentificeerd in BN en HC (aanvullende tabel 2), consistent met de overlap tussen BN en HC in PLS-DA.Deze differentiële metabolieten bestrijken een breed scala aan biochemicaliën (aanvullende figuur 4).Alles bij elkaar laten deze resultaten significante veranderingen zien in het serummetaboloom die de kwaadaardige transformatie van longkanker in een vroeg stadium weerspiegelen in vergelijking met goedaardige longknobbeltjes of gezonde proefpersonen.Ondertussen suggereert de gelijkenis van het serummetaboloom van BN en HC dat goedaardige longknobbeltjes veel biologische kenmerken kunnen delen met gezonde individuen.Gegeven dat genmutaties in de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) vaak voorkomen bij longadenocarcinoom subtype 23, hebben we geprobeerd de impact van driver-mutaties op het serummetaboloom te bepalen.Vervolgens analyseerden we het algehele metabolomische profiel van 72 gevallen met EGFR-status in de longadenocarcinoomgroep.Interessant genoeg vonden we vergelijkbare profielen tussen EGFR-mutante patiënten (n = 41) en EGFR-wildtype patiënten (n = 31) in PCA-analyse (aanvullende figuur 5a).We identificeerden echter 7 metabolieten waarvan de overvloed significant was veranderd bij patiënten met EGFR-mutatie vergeleken met patiënten met wildtype EGFR (t-test, p <0,05 en vouwverandering> 1,2 of <0,83) (aanvullende figuur 5b).De meerderheid van deze metabolieten (5 van de 7) zijn acylcarnitines, die een belangrijke rol spelen in de vetzuuroxidatieroutes.
Zoals geïllustreerd in de workflow getoond in Figuur 2a, werden biomarkers voor knobbelclassificatie verkregen met behulp van operatoren voor de minste absolute krimp en selectie op basis van 33 differentiële metabolieten geïdentificeerd in LA (n = 136) en BN (n = 170).Beste combinatie van variabelen (LASSO) – binair logistisch regressiemodel.Er werd gebruik gemaakt van tienvoudige kruisvalidatie om de betrouwbaarheid van het model te testen.Variabeleselectie en parameterregularisatie worden aangepast door een waarschijnlijkheidsmaximalisatiestraf met parameter λ24.Globale metabolomics-analyse werd verder onafhankelijk uitgevoerd in de interne validatie (n = 104) en externe validatie (n = 111) groepen om de classificatieprestaties van het discriminantmodel te testen.Als resultaat werden 27 metabolieten in de ontdekkingsset geïdentificeerd als het beste discriminante model met de grootste gemiddelde AUC-waarde (Fig. 2b), waarvan 9 verhoogde activiteit hadden en 18 verminderde activiteit in LA vergeleken met BN (Fig. 2c).
Workflow voor het bouwen van een classificatie voor longknobbeltjes, inclusief het selecteren van het beste panel van serummetabolieten in de ontdekkingsset met behulp van een binair logistisch regressiemodel via tienvoudige kruisvalidatie en het evalueren van voorspellende prestaties in interne en externe validatiesets.b Kruisvalidatiestatistieken van het LASSO-regressiemodel voor de selectie van metabolische biomarkers.De hierboven gegeven getallen vertegenwoordigen het gemiddelde aantal biomarkers dat bij een gegeven λ is geselecteerd.De rode stippellijn geeft de gemiddelde AUC-waarde weer bij de overeenkomstige lambda.Grijze foutbalken vertegenwoordigen de minimale en maximale AUC-waarden.De stippellijn geeft het beste model aan met de 27 geselecteerde biomarkers.AUC, oppervlakte onder de ROC-curve (ontvanger-bedrijfskarakteristiek).c Vouw veranderingen van 27 geselecteerde metabolieten in de LA-groep vergeleken met de BN-groep in de ontdekkingsgroep.Rode kolom – activering.De blauwe kolom is een daling.d – f Ontvanger-bedrijfskarakteristieken (ROC-curven) die de kracht van het discriminantmodel tonen op basis van 27 metabolietencombinaties in de ontdekkings-, interne en externe validatiesets.Brongegevens worden aangeleverd in de vorm van brongegevensbestanden.
Er werd een voorspellingsmodel gemaakt op basis van de gewogen regressiecoëfficiënten van deze 27 metabolieten (aanvullende tabel 3).ROC-analyse op basis van deze 27 metabolieten leverde een oppervlakte onder de curve (AUC)-waarde op van 0,933, de gevoeligheid van de ontdekkingsgroep was 0,868 en de specificiteit was 0,859 (figuur 2d).Ondertussen bereikte een reeks van 16 metabolieten van de 38 geannoteerde differentiële metabolieten tussen LA en HC een AUC van 0,902 met een gevoeligheid van 0,801 en een specificiteit van 0,856 bij het onderscheiden van LA van HC (aanvullende figuur 6a-c).AUC-waarden gebaseerd op verschillende drempels voor vouwverandering voor verschillende metabolieten werden ook vergeleken.We ontdekten dat het classificatiemodel het beste presteerde bij het maken van onderscheid tussen LA en BN (HC) wanneer het vouwveranderingsniveau was ingesteld op 1,2 versus 1,5 of 2,0 (aanvullende figuur 7a, b).Het classificatiemodel, gebaseerd op 27 metabolietengroepen, werd verder gevalideerd in interne en externe cohorten.De AUC was 0,915 (gevoeligheid 0,867, specificiteit 0,811) voor interne validatie en 0,945 (gevoeligheid 0,810, specificiteit 0,979) voor externe validatie (Fig. 2e, f).Om de interlaboratoriumefficiëntie te beoordelen, werden 40 monsters uit het externe cohort geanalyseerd in een extern laboratorium, zoals beschreven in de sectie Methoden.De classificatienauwkeurigheid bereikte een AUC van 0,925 (aanvullende figuur 8).Omdat plaveiselcelcarcinoom van de longen (LUSC) het op één na meest voorkomende subtype van niet-kleincellige longkanker (NSCLC) is, na longadenocarcinoom (LUAD), hebben we ook het gevalideerde potentiële nut van metabolische profielen getest.BN en 16 gevallen van LUSC.De AUC van discriminatie tussen LUSC en BN was 0,776 (aanvullende figuur 9), wat wijst op een slechter vermogen vergeleken met discriminatie tussen LUAD en BN.
Studies hebben aangetoond dat de grootte van knobbeltjes op CT-beelden positief gecorreleerd is met de waarschijnlijkheid van maligniteit en een belangrijke bepalende factor blijft voor de behandeling van knobbeltjes25,26,27.Uit analyse van gegevens uit het grote cohort van het NELSON-screeningsonderzoek bleek dat het risico op maligniteit bij proefpersonen met klieren <5 mm zelfs vergelijkbaar was met dat bij proefpersonen zonder klieren 28 .Daarom is de minimale grootte die regelmatige CT-monitoring vereist 5 mm, zoals aanbevolen door de British Thoracic Society (BTS), en 6 mm, zoals aanbevolen door de Fleischner Society 29 .Noduli groter dan 6 mm en zonder duidelijke goedaardige kenmerken, de zogenaamde onbepaalde longnoduli (IPN), blijven echter een grote uitdaging bij de evaluatie en behandeling in de klinische praktijk30,31.We onderzochten vervolgens of de grootte van de knobbel de metabolomische handtekeningen beïnvloedde met behulp van gepoolde monsters uit de ontdekkings- en interne validatiecohorten.Door ons te concentreren op 27 gevalideerde biomarkers, vergeleken we eerst de PCA-profielen van HC- en BN-metabolomen van minder dan 6 mm.We ontdekten dat de meeste gegevenspunten voor HC en BN elkaar overlapten, wat aantoont dat de serummetabolietenniveaus in beide groepen vergelijkbaar waren (Fig. 3a).De kenmerkkaarten over verschillende groottebereiken bleven geconserveerd in BN en LA (Fig. 3b, c), terwijl een scheiding werd waargenomen tussen kwaadaardige en goedaardige knobbeltjes in het bereik van 6-20 mm (Fig. 3d).Dit cohort had een AUC van 0,927, specificiteit van 0,868 en gevoeligheid van 0,820 voor het voorspellen van de maligniteit van knobbeltjes van 6 tot 20 mm (Fig. 3e, f).Onze resultaten laten zien dat de classificator metabolische veranderingen kan vastleggen die worden veroorzaakt door vroege kwaadaardige transformatie, ongeacht de grootte van de knobbel.
ad Vergelijking van PCA-profielen tussen gespecificeerde groepen op basis van een metabolische classificator van 27 metabolieten.CC en BN < 6 mm.b BN <6 mm versus BN 6–20 mm.in LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm.gBN 6–20 mm en LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Ontvanger-bedrijfskarakteristiek (ROC)-curve die de discriminante modelprestaties toont voor knobbeltjes 6–20 mm.f Waarschijnlijkheidswaarden werden berekend op basis van het logistische regressiemodel voor knobbeltjes van 6-20 mm.De grijze stippellijn vertegenwoordigt de optimale grenswaarde (0,455).De bovenstaande cijfers vertegenwoordigen het verwachte percentage gevallen voor Los Angeles.Gebruik een tweezijdige Student's t-toets.PCA, hoofdcomponentenanalyse.AUC-gebied onder de curve.Brongegevens worden aangeleverd in de vorm van brongegevensbestanden.
Vier monsters (44-61 jaar oud) met vergelijkbare longknobbels (7-9 mm) werden verder geselecteerd om de prestaties van het voorgestelde maligniteitsvoorspellingsmodel te illustreren (Fig. 4a, b).Bij de eerste screening presenteerde geval 1 zich als een solide knobbel met verkalking, een kenmerk dat verband houdt met goedaardigheid, terwijl geval 2 zich presenteerde als een onbepaalde, gedeeltelijk solide knobbel zonder duidelijke goedaardige kenmerken.Drie rondes van vervolg-CT-scans lieten zien dat deze gevallen gedurende een periode van vier jaar stabiel bleven en daarom als goedaardige knobbeltjes werden beschouwd (figuur 4a).Vergeleken met de klinische evaluatie van seriële CT-scans identificeerde single-shot serummetabolietenanalyse met het huidige classificatiemodel deze goedaardige knobbeltjes snel en correct op basis van probabilistische beperkingen (Tabel 1).Figuur 4b toont in geval 3 een knobbel met tekenen van pleurale terugtrekking, die meestal gepaard gaat met maligniteit32.Geval 4 presenteerde zich als een onbepaalde, gedeeltelijk solide knobbel zonder bewijs van een goedaardige oorzaak.Al deze gevallen werden voorspeld als kwaadaardig volgens het classificatiemodel (Tabel 1).De beoordeling van longadenocarcinoom werd aangetoond door histopathologisch onderzoek na longresectiechirurgie (Fig. 4b).Voor de externe validatieset voorspelde de metabolische classificator nauwkeurig twee gevallen van onbepaalde longknobbeltjes groter dan 6 mm (aanvullende figuur 10).
CT-beelden van het axiale venster van de longen van twee gevallen van goedaardige knobbeltjes.In geval 1 vertoonde de CT-scan na 4 jaar een stabiele vaste knobbel van 7 mm met verkalking in de rechter onderkwab.In geval 2 toonde de CT-scan na 5 jaar een stabiele, gedeeltelijk vaste knobbel met een diameter van 7 mm in de rechter bovenkwab.b Axiale venster-CT-beelden van de longen en overeenkomstig pathologisch onderzoek van twee gevallen van stadium I-adenocarcinoom vóór longresectie.Casus 3 onthulde een knobbel met een diameter van 8 mm in de rechter bovenkwab met pleurale terugtrekking.Geval 4 onthulde een gedeeltelijk massieve geslepen glasknobbel van 9 mm in de linker bovenkwab.Hematoxyline- en eosine (H&E) kleuring van gereseceerd longweefsel (schaalbalk = 50 μm) die het acinaire groeipatroon van longadenocarcinoom aantoont.Pijlen geven knobbeltjes aan die op CT-beelden zijn gedetecteerd.H&E-beelden zijn representatieve beelden van meerdere (>3) microscopische velden die door de patholoog worden onderzocht.
Alles bij elkaar genomen demonstreren onze resultaten de potentiële waarde van serummetabolietbiomarkers bij de differentiële diagnose van longknobbeltjes, wat uitdagingen kan opleveren bij het evalueren van CT-screening.
Op basis van een gevalideerd differentieel metabolietenpanel probeerden we biologische correlaten van belangrijke metabolische veranderingen te identificeren.KEGG-pathwayverrijkingsanalyse door MetaboAnalyst identificeerde 6 veel voorkomende significant veranderde routes tussen de twee gegeven groepen (LA vs. HC en LA vs. BN, aangepaste p ≤ 0,001, effect> 0,01).Deze veranderingen werden gekenmerkt door stoornissen in het pyruvaatmetabolisme, het tryptofaanmetabolisme, het niacine- en nicotinamidemetabolisme, de glycolyse, de TCA-cyclus en het purinemetabolisme (Fig. 5a).Vervolgens hebben we gerichte metabolomics verder uitgevoerd om grote veranderingen te verifiëren met behulp van absolute kwantificering.Bepaling van veel voorkomende metabolieten in vaak veranderde routes door middel van drievoudige quadrupoolmassaspectrometrie (QQQ) met behulp van authentieke metabolietenstandaarden.Demografische kenmerken van het doelmonster van het metabolomics-onderzoek zijn opgenomen in aanvullende tabel 4. In overeenstemming met onze globale metabolomics-resultaten bevestigde kwantitatieve analyse dat hypoxanthine en xanthine, pyruvaat en lactaat verhoogd waren in LA vergeleken met BN en HC (Fig. 5b, c, p<0,05).Er werden echter geen significante verschillen in deze metabolieten gevonden tussen BN en HC.
KEGG-routeverrijkingsanalyse van significant verschillende metabolieten in de LA-groep vergeleken met de BN- en HC-groepen.Er werd gebruik gemaakt van een tweezijdige Globaltest en p-waarden werden aangepast met behulp van de Holm-Bonferroni-methode (aangepast p ≤ 0,001 en effectgrootte > 0,01).b – d Vioolgrafieken die hypoxanthine-, xanthine-, lactaat-, pyruvaat- en tryptofaanniveaus tonen in serum HC, BN en LA bepaald door LC-MS / MS (n = 70 per groep).Witte en zwarte stippellijnen geven respectievelijk de mediaan en het kwartiel aan.e Vioolplot die genormaliseerde Log2TPM (transcripten per miljoen) mRNA-expressie van SLC7A5 en QPRT toont in longadenocarcinoom (n = 513) vergeleken met normaal longweefsel (n = 59) in de LUAD-TCGA-dataset.Het witte vak vertegenwoordigt het interkwartielbereik, de horizontale zwarte lijn in het midden vertegenwoordigt de mediaan en de verticale zwarte lijn die zich vanuit het vak uitstrekt, vertegenwoordigt het 95% betrouwbaarheidsinterval (BI).f Pearson-correlatiegrafiek van SLC7A5- en GAPDH-expressie in longadenocarcinoom (n = 513) en normaal longweefsel (n = 59) in de TCGA-dataset.Het grijze gebied vertegenwoordigt het 95% BI.r, Pearson-correlatiecoëfficiënt.g Genormaliseerde cellulaire tryptofaanniveaus in A549-cellen getransfecteerd met niet-specifieke shRNA-controle (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bepaald door LC-MS/MS.Er wordt een statistische analyse van vijf biologisch onafhankelijke monsters in elke groep gepresenteerd.h Cellulaire niveaus van NADt (totaal NAD, inclusief NAD+ en NADH) in A549-cellen (NC) en SLC7A5 knockdown A549-cellen (Sh1, Sh2).Er wordt een statistische analyse van drie biologisch onafhankelijke monsters in elke groep gepresenteerd.i De glycolytische activiteit van A549-cellen voor en na de knockdown van SLC7A5 werd gemeten aan de hand van de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) (n = 4 biologisch onafhankelijke monsters per groep).2-DG,2-deoxy-D-glucose.Tweezijdige Student's t-test werd gebruikt in (b – h).In (g – i) vertegenwoordigen foutbalken het gemiddelde ± SD, elk experiment werd drie keer onafhankelijk uitgevoerd en de resultaten waren vergelijkbaar.Brongegevens worden aangeleverd in de vorm van brongegevensbestanden.
Gezien de significante impact van het veranderde tryptofaanmetabolisme in de LA-groep, hebben we ook de serumtryptofaanniveaus in de HC-, BN- en LA-groepen beoordeeld met behulp van QQQ.We ontdekten dat serumtryptofaan verlaagd was in LA vergeleken met HC of BN (p < 0,001, figuur 5d), wat consistent is met eerdere bevindingen dat de circulerende tryptofaanniveaus lager zijn bij patiënten met longkanker dan bij gezonde controles uit de controlegroep33,34 ,35.Uit een ander onderzoek waarbij PET/CT-tracer 11C-methyl-L-tryptofaan werd gebruikt, bleek dat de retentietijd van het tryptofaansignaal in longkankerweefsel aanzienlijk was toegenomen in vergelijking met goedaardige laesies of normaal weefsel36.We veronderstellen dat de afname van tryptofaan in LA-serum een weerspiegeling kan zijn van de actieve opname van tryptofaan door longkankercellen.
Het is ook bekend dat het eindproduct van de kynurenineroute van tryptofaankatabolisme NAD+37,38 is, wat een belangrijk substraat is voor de reactie van glyceraldehyde-3-fosfaat met 1,3-bisfosfoglyceraat bij glycolyse39.Terwijl eerdere studies zich hebben geconcentreerd op de rol van tryptofaankatabolisme bij immuunregulatie, hebben we geprobeerd de wisselwerking tussen ontregeling van tryptofaan en glycolytische routes die in de huidige studie zijn waargenomen, op te helderen.Het is bekend dat transporterfamilie 7 lid 5 van opgeloste stoffen (SLC7A5) een tryptofaantransporter is43,44,45.Quinolinezuurfosforibosyltransferase (QPRT) is een enzym dat zich stroomafwaarts van de kynurenineroute bevindt en dat chinolinezuur omzet in NAMN46.Inspectie van de LUAD TCGA-dataset onthulde dat zowel SLC7A5 als QPRT significant opgereguleerd waren in tumorweefsel vergeleken met normaal weefsel (Fig. 5e).Deze toename werd waargenomen in de stadia I en II, evenals de stadia III en IV van longadenocarcinoom (aanvullende figuur 11), wat wijst op vroege verstoringen in het tryptofaanmetabolisme geassocieerd met tumorigenese.
Bovendien vertoonde de LUAD-TCGA-dataset een positieve correlatie tussen SLC7A5 en GAPDH-mRNA-expressie in monsters van kankerpatiënten (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figuur 5f).Daarentegen werd er geen significante correlatie gevonden tussen dergelijke gensignaturen in normaal longweefsel (r = 0,25, p = 0,06, figuur 5f).Knockdown van SLC7A5 (aanvullende figuur 12) in A549-cellen verminderde de cellulaire tryptofaan- en NAD(H)-niveaus aanzienlijk (figuur 5g, h), resulterend in verzwakte glycolytische activiteit zoals gemeten aan de hand van de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) (figuur 1).5i).Op basis van metabolische veranderingen in serum en in vitro detectie veronderstellen we dus dat het tryptofaanmetabolisme NAD+ kan produceren via de kynurenineroute en een belangrijke rol kan spelen bij het bevorderen van de glycolyse bij longkanker.
Studies hebben aangetoond dat een groot aantal onbepaalde longknobbeltjes die door LDCT worden gedetecteerd, kan leiden tot de noodzaak van aanvullende tests, zoals PET-CT, longbiopsie en overbehandeling als gevolg van een vals-positieve diagnose van maligniteit.31 Zoals weergegeven in Figuur 6, onze studie identificeerde een panel van serummetabolieten met potentiële diagnostische waarde die de risicostratificatie en daaropvolgende behandeling van longknobbeltjes gedetecteerd door CT zouden kunnen verbeteren.
Longknobbeltjes worden geëvalueerd met behulp van lage dosis computertomografie (LDCT) met beeldkenmerken die wijzen op goedaardige of kwaadaardige oorzaken.De onzekere uitkomst van knobbeltjes kan leiden tot frequente vervolgbezoeken, onnodige interventies en overbehandeling.De opname van serummetabolische classificatoren met diagnostische waarde kan de risicobeoordeling en de daaropvolgende behandeling van longknobbeltjes verbeteren.PET-positronemissietomografie.
Gegevens uit de Amerikaanse NLST-studie en de Europese NELSON-studie suggereren dat screening van hoogrisicogroepen met lage dosis computertomografie (LDCT) de sterfte aan longkanker kan verminderen1,3.De risicobeoordeling en de daaropvolgende klinische behandeling van grote aantallen incidentele longknobbeltjes die door LDCT worden gedetecteerd, blijven echter de meest uitdagende.Het belangrijkste doel is om de correcte classificatie van bestaande op LDCT gebaseerde protocollen te optimaliseren door betrouwbare biomarkers te integreren.
Bepaalde moleculaire biomarkers, zoals bloedmetabolieten, zijn geïdentificeerd door longkanker te vergelijken met gezonde controles15,17.In de huidige studie concentreerden we ons op de toepassing van serummetabolomics-analyse om onderscheid te maken tussen goedaardige en kwaadaardige longknobbels die incidenteel werden gedetecteerd door LDCT.We vergeleken het globale serummetaboloom van gezonde controle (HC), goedaardige longknobbeltjes (BN) en stadium I longadenocarcinoom (LA) monsters met behulp van UPLC-HRMS-analyse.We ontdekten dat HC en BN vergelijkbare metabolische profielen hadden, terwijl LA significante veranderingen vertoonde vergeleken met HC en BN.We hebben twee sets serummetabolieten geïdentificeerd die LA onderscheiden van HC en BN.
Het huidige op LDCT gebaseerde identificatieschema voor goedaardige en kwaadaardige knobbeltjes is voornamelijk gebaseerd op de grootte, dichtheid, morfologie en groeisnelheid van knobbeltjes in de loop van de tijd30.Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat de grootte van knobbeltjes nauw verband houdt met de kans op longkanker.Zelfs bij hoogrisicopatiënten is het risico op maligniteit in klieren <6 mm <1%.Het risico op maligniteit voor knobbeltjes van 6 tot 20 mm varieert van 8% tot 64%30.Daarom beveelt de Fleischner Society een afsnijdiameter van 6 mm aan voor routinematige CT-follow-up.29 De risicobeoordeling en behandeling van onbepaalde longknobbeltjes (IPN) groter dan 6 mm zijn echter niet adequaat uitgevoerd 31 .De huidige behandeling van aangeboren hartziekten is meestal gebaseerd op waakzaam wachten met frequente CT-monitoring.
Op basis van het gevalideerde metaboloom hebben we voor het eerst de overlap van metabolomische kenmerken tussen gezonde individuen en goedaardige knobbeltjes <6 mm aangetoond.De biologische gelijkenis komt overeen met eerdere CT-bevindingen dat het risico op maligniteit bij knobbeltjes <6 mm net zo laag is als bij proefpersonen zonder klieren.30 Opgemerkt moet worden dat onze resultaten ook aantonen dat goedaardige knobbeltjes <6 mm en ≥6 mm een hoge mate van kanker hebben. gelijkenis in metabolomische profielen, wat suggereert dat de functionele definitie van goedaardige etiologie consistent is, ongeacht de grootte van de knobbel.Moderne diagnostische serummetabolietenpanels kunnen dus een enkele test bieden als uitsluitingstest wanneer knobbeltjes in eerste instantie op CT worden gedetecteerd en mogelijk de seriële monitoring verminderen.Tegelijkertijd onderscheidde hetzelfde panel van metabolische biomarkers kwaadaardige knobbeltjes met een grootte van ≥6 mm van goedaardige knobbeltjes en leverde het nauwkeurige voorspellingen op voor IPN's van vergelijkbare grootte en dubbelzinnige morfologische kenmerken op CT-beelden.Deze serummetabolismeclassificator presteerde goed bij het voorspellen van de maligniteit van knobbeltjes ≥6 mm met een AUC van 0,927.Alles bij elkaar geven onze resultaten aan dat unieke serummetabolomische kenmerken specifiek vroege door tumoren geïnduceerde metabolische veranderingen kunnen weerspiegelen en potentiële waarde kunnen hebben als risicovoorspellers, onafhankelijk van de grootte van de knobbel.
Met name longadenocarcinoom (LUAD) en plaveiselcelcarcinoom (LUSC) zijn de belangrijkste typen niet-kleincellige longkanker (NSCLC).Gegeven dat LUSC sterk geassocieerd is met tabaksgebruik47 en LUAD de meest voorkomende histologie is van incidentele longknobbeltjes gedetecteerd bij CT-screening48, werd ons classificatiemodel specifiek gebouwd voor stadium I-adenocarcinoommonsters.Wang en collega's concentreerden zich ook op LUAD en identificeerden negen lipidensignaturen met behulp van lipidomics om longkanker in een vroeg stadium te onderscheiden van gezonde individuen17.We hebben het huidige classificatiemodel getest op 16 gevallen van stadium I LUSC en 74 goedaardige knobbeltjes en hebben een lage LUSC-voorspellingsnauwkeurigheid waargenomen (AUC 0,776), wat suggereert dat LUAD en LUSC mogelijk hun eigen metabolomische kenmerken hebben.Er is inderdaad aangetoond dat LUAD en LUSC verschillen wat betreft etiologie, biologische oorsprong en genetische afwijkingen49.Daarom moeten andere soorten histologie worden opgenomen in trainingsmodellen voor populatiegebaseerde detectie van longkanker in screeningprogramma's.
Hier identificeerden we de zes meest frequent veranderde routes bij longadenocarcinoom vergeleken met gezonde controles en goedaardige knobbeltjes.Xanthine en hypoxanthine zijn veel voorkomende metabolieten van de purinemetabolische route.In overeenstemming met onze resultaten waren tussenproducten geassocieerd met het purinemetabolisme significant verhoogd in het serum of de weefsels van patiënten met longadenocarcinoom vergeleken met gezonde controles of patiënten in het pre-invasieve stadium15,50.Verhoogde serumxanthine- en hypoxanthinespiegels kunnen het anabolisme weerspiegelen dat nodig is voor snel prolifererende kankercellen.Ontregeling van het glucosemetabolisme is een bekend kenmerk van het kankermetabolisme51.Hier hebben we een significante toename van pyruvaat en lactaat waargenomen in de LA-groep vergeleken met de HC- en BN-groep, wat consistent is met eerdere rapporten over afwijkingen in de glycolytische route in de serummetaboloomprofielen van niet-kleincellige longkanker (NSCLC) patiënten en gezonde controles.de resultaten zijn consistent52,53.
Belangrijk is dat we een omgekeerde correlatie hebben waargenomen tussen het pyruvaat- en tryptofaanmetabolisme in het serum van longadenocarcinomen.De serumtryptofaanspiegels waren verlaagd in de LA-groep vergeleken met de HC- of BN-groep.Interessant is dat uit een eerder grootschalig onderzoek met een prospectief cohort bleek dat lage niveaus van circulerend tryptofaan geassocieerd waren met een verhoogd risico op longkanker 54 .Tryptofaan is een essentieel aminozuur dat we volledig uit voedsel halen.We concluderen dat de uitputting van serumtryptofaan bij longadenocarcinoom een snelle uitputting van deze metaboliet kan weerspiegelen.Het is algemeen bekend dat het eindproduct van het tryptofaankatabolisme via de kynurenineroute de bron is van de novo NAD+-synthese.Omdat NAD+ voornamelijk via de bergingsroute wordt geproduceerd, moet het belang van NAD+ in het tryptofaanmetabolisme bij gezondheid en ziekte nog worden bepaald46.Onze analyse van de TCGA-database toonde aan dat de expressie van de tryptofaantransporter opgeloste stoftransporter 7A5 (SLC7A5) significant verhoogd was bij longadenocarcinoom vergeleken met normale controles en positief gecorreleerd was met de expressie van het glycolytische enzym GAPDH.Eerdere studies hebben zich vooral gericht op de rol van tryptofaankatabolisme bij het onderdrukken van de antitumorale immuunrespons40,41,42.Hier demonstreren we dat remming van de opname van tryptofaan door knockdown van SLC7A5 in longkankercellen resulteert in een daaropvolgende afname van cellulaire NAD-niveaus en een daarmee gepaard gaande verzwakking van de glycolytische activiteit.Samenvattend biedt onze studie een biologische basis voor veranderingen in het serummetabolisme geassocieerd met kwaadaardige transformatie van longadenocarcinoom.
EGFR-mutaties zijn de meest voorkomende driver-mutaties bij patiënten met NSCLC.In onze studie ontdekten we dat patiënten met een EGFR-mutatie (n = 41) algemene metabolomische profielen hadden die vergelijkbaar waren met die van patiënten met wildtype EGFR (n = 31), hoewel we verlaagde serumspiegels van sommige EGFR-mutante patiënten bij acylcarnitinepatiënten aantroffen.De gevestigde functie van acylcarnitines is het transporteren van acylgroepen van het cytoplasma naar de mitochondriale matrix, wat leidt tot de oxidatie van vetzuren om energie te produceren 55 .In overeenstemming met onze bevindingen identificeerde een recente studie ook vergelijkbare metaboloomprofielen tussen EGFR-mutant en EGFR-wildtype tumoren door het globale metaboloom van 102 longadenocarcinoomweefselmonsters te analyseren.Interessant genoeg werd het acylcarnitinegehalte ook gevonden in de EGFR-mutantgroep.Daarom kan de vraag of veranderingen in de acylcarnitinespiegels een weerspiegeling zijn van door EGFR geïnduceerde metabolische veranderingen en de onderliggende moleculaire routes verder onderzoek verdienen.
Concluderend stelt onze studie een serummetabolische classificator vast voor de differentiële diagnose van longknobbeltjes en stelt een workflow voor die de risicobeoordeling kan optimaliseren en het klinische management kan vergemakkelijken op basis van CT-scanscreening.
Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Sun Yat-sen Universitair Kankerziekenhuis, het eerste aangesloten ziekenhuis van de Sun Yat-sen Universiteit en de Ethische Commissie van het Zhengzhou Universitair Kankerziekenhuis.In de ontdekkings- en interne validatiegroepen werden 174 sera van gezonde individuen en 244 sera van goedaardige knobbeltjes verzameld van individuen die jaarlijkse medische onderzoeken ondergingen bij het Department of Cancer Control and Prevention, Sun Yat-sen University Cancer Center, en 166 goedaardige knobbeltjes.serum.Stadium I-longadenocarcinomen werden verzameld bij het Sun Yat-sen University Cancer Center.In het externe validatiecohort waren er 48 gevallen van goedaardige knobbeltjes, 39 gevallen van stadium I longadenocarcinoom van het First Affiliated Hospital van de Sun Yat-sen Universiteit, en 24 gevallen van stadium I longadenocarcinoom van het Zhengzhou Cancer Hospital.Het Sun Yat-sen University Cancer Center verzamelde ook 16 gevallen van plaveiselcel-longkanker in stadium I om het diagnostische vermogen van de gevestigde metabolische classificator te testen (patiëntkenmerken worden weergegeven in aanvullende tabel 5).Steekproeven uit het ontdekkingscohort en het interne validatiecohort werden verzameld tussen januari 2018 en mei 2020. Steekproeven voor het externe validatiecohort werden verzameld tussen augustus 2021 en oktober 2022. Om gendervooroordelen te minimaliseren, werden aan elk ongeveer gelijke aantallen mannelijke en vrouwelijke gevallen toegewezen. cohort.Ontdekkingsteam en intern beoordelingsteam.Het geslacht van de deelnemer werd bepaald op basis van zelfrapportage.Van alle deelnemers werd geïnformeerde toestemming verkregen en er werd geen compensatie verstrekt.Proefpersonen met goedaardige knobbeltjes waren degenen met een stabiele CT-scanscore na 2 tot 5 jaar op het moment van analyse, met uitzondering van 1 geval uit het externe validatiemonster, dat preoperatief werd verzameld en door histopathologie werd gediagnosticeerd.Met uitzondering van chronische bronchitis.Gevallen van longadenocarcinoom werden verzameld vóór longresectie en bevestigd door pathologische diagnose.Nuchtere bloedmonsters werden verzameld in serumscheidingsbuizen zonder enige anticoagulantia.Bloedmonsters werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gestold en vervolgens gedurende 10 minuten bij 4°C bij 2851 x g gecentrifugeerd om de supernatant van het serum te verzamelen.Serumhoeveelheden werden bij -80°C bevroren tot de extractie van de metabolieten.De afdeling Kankerpreventie en Medisch Onderzoek van het Sun Yat-sen Universitair Kankercentrum verzamelde een verzameling serum van 100 gezonde donoren, waaronder een gelijk aantal mannen en vrouwen in de leeftijd van 40 tot 55 jaar.Gelijke volumes van elk donormonster werden gemengd, de resulterende verzameling werd in porties verdeeld en bij -80°C bewaard.Het serummengsel werd gebruikt als referentiemateriaal voor kwaliteitscontrole en gegevensstandaardisatie.
Referentieserum en testmonsters werden ontdooid en de metabolieten werden geëxtraheerd met behulp van een gecombineerde extractiemethode (MTBE/methanol/water) 56 .In het kort werd 50 μl serum gemengd met 225 μl ijskoude methanol en 750 μl ijskoude methyl-tert-butylether (MTBE).Roer het mengsel en incubeer gedurende 1 uur op ijs.De monsters werden vervolgens gemengd en vortex gemengd met 188 μl water van MS-kwaliteit dat interne standaarden bevatte (13C-lactaat, 13C3-pyruvaat, 13C-methionine en 13C6-isoleucine, gekocht bij Cambridge Isotope Laboratories).Het mengsel werd vervolgens 10 minuten bij 4 ° C bij 15.000 x g gecentrifugeerd en de onderste fase werd overgebracht naar twee buizen (elk 125 μl) voor LC-MS-analyse in positieve en negatieve modi.Tenslotte werd het monster drooggedampt in een hogesnelheidsvacuümconcentrator.
De gedroogde metabolieten werden gereconstitueerd in 120 μl 80% acetonitril, 5 minuten gewerveld en 10 minuten bij 4 ° C bij 15.000 x g gecentrifugeerd.Supernatanten werden overgebracht naar amberkleurige glazen flesjes met micro-inserts voor metabolomics-onderzoeken.Ongerichte metabolomics-analyse op een ultra-performance vloeistofchromatografie-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)-platform.Metabolieten werden gescheiden met behulp van een Dionex Ultimate 3000 UPLC-systeem en een ACQUITY BEH Amide-kolom (2,1 x 100 mm, 1,7 μm, Waters).In de positieve ionmodus waren de mobiele fasen 95% (A) en 50% acetonitril (B), die elk 10 mmol/L ammoniumacetaat en 0,1% mierenzuur bevatten.In negatieve modus bevatten mobiele fasen A en B respectievelijk 95% en 50% acetonitril, beide fasen bevatten 10 mmol / L ammoniumacetaat, pH = 9. Het gradiëntprogramma was als volgt: 0-0,5 min, 2% B;0,5–12 minuten, 2–50% B;12–14 minuten, 50–98% B;14–16 minuten, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1–20 min, 2% B. De kolom werd in de autosampler op 40°C gehouden en het monster op 10°C.De stroomsnelheid was 0,3 ml/min, het injectievolume was 3 μl.Een Q-Exactive Orbitrap-massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific) met een elektrospray-ionisatiebron (ESI) werd in volledige scanmodus gebruikt en gekoppeld aan de ddMS2-bewakingsmodus om grote hoeveelheden gegevens te verzamelen.De MS-parameters werden als volgt ingesteld: sproeispanning +3,8 kV/- 3,2 kV, capillaire temperatuur 320 °C, beschermgas 40 arb, hulpgas 10 arb, temperatuur van de sondeverwarming 350 °C, scanbereik 70–1050 m/uur, oplossing.70.000. Gegevens werden verkregen met behulp van Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Om de gegevenskwaliteit te beoordelen, werden gepoolde kwaliteitscontrolemonsters (QC) gegenereerd door aliquots van 10 μl van het supernatant uit elk monster te verwijderen.Aan het begin van de analytische reeks werden zes kwaliteitscontrolemonsterinjecties geanalyseerd om de stabiliteit van het UPLC-MS-systeem te beoordelen.Kwaliteitscontrolemonsters worden vervolgens periodiek in de batch geïntroduceerd.Alle 11 batches serummonsters in dit onderzoek werden geanalyseerd met LC-MS.Porties van een serumpoolmengsel van 100 gezonde donoren werden gebruikt als referentiemateriaal in de respectieve batches om het extractieproces te volgen en de effecten van batch tot batch aan te passen.Ongerichte metabolomics-analyse van het ontdekkingscohort, het interne validatiecohort en het externe validatiecohort werd uitgevoerd in het Metabolomics Center van de Sun Yat-sen Universiteit.Het externe laboratorium van het Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center analyseerde ook 40 monsters uit het externe cohort om de prestaties van het classificatiemodel te testen.
Na extractie en reconstitutie werd de absolute kwantificering van serummetabolieten gemeten met behulp van ultrahoge vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie (Agilent 6495 triple quadrupool) met een elektrospray-ionisatie (ESI) bron in multiple reaction monitoring (MRM)-modus.Een ACQUITY BEH Amide-kolom (2,1 x 100 mm, 1,7 μm, Waters) werd gebruikt om metabolieten te scheiden.De mobiele fase bestond uit 90% (A) en 5% acetonitril (B) met 10 mmol/L ammoniumacetaat en 0,1% ammoniakoplossing.Het gradiëntprogramma was als volgt: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 minuten, 0–15% B;6,5–8 minuten, 15% B;8–8,5 minuten, 15%–0% B;8,5–11,5 min., 0%B.De kolom werd in de autosampler op 40 °C gehouden en het monster op 10 °C.De stroomsnelheid was 0,3 ml/min en het injectievolume was 1 μl.MS-parameters werden als volgt ingesteld: capillaire spanning ±3,5 kV, vernevelaardruk 35 psi, stroom van omhulselgas 12 l/min, temperatuur van omhulselgas 350°C, temperatuur van drooggas 250°C en stroom van drooggas 14 l/min.De MRM-conversies van tryptofaan, pyruvaat, lactaat, hypoxanthine en xanthine waren 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 en 151,0–107.9 respectievelijk.Gegevens werden verzameld met behulp van Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Voor serummonsters werden tryptofaan, pyruvaat, lactaat, hypoxanthine en xanthine gekwantificeerd met behulp van kalibratiecurven van standaardmengseloplossingen.Voor celmonsters werd het tryptofaangehalte genormaliseerd naar de interne standaard en de celeiwitmassa.
Piekextractie (m/z en retentietijd (RT)) werd uitgevoerd met behulp van Compound Discovery 3.1 en TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Om potentiële verschillen tussen batches te elimineren, werd elke karakteristieke piek van het testmonster gedeeld door de karakteristieke piek van het referentiemateriaal uit dezelfde batch om de relatieve overvloed te verkrijgen.De relatieve standaardafwijkingen van interne standaarden voor en na standaardisatie worden weergegeven in aanvullende tabel 6. Verschillen tussen de twee groepen werden gekenmerkt door het percentage valse ontdekkingen (FDR <0,05, Wilcoxon ondertekende rangtest) en vouwverandering (> 1,2 of <0,83).Ruwe MS-gegevens van de geëxtraheerde kenmerken en referentieserum-gecorrigeerde MS-gegevens worden respectievelijk weergegeven in Aanvullende Gegevens 1 en Aanvullende Gegevens 2.Piekannotatie werd uitgevoerd op basis van vier gedefinieerde identificatieniveaus, waaronder geïdentificeerde metabolieten, vermoedelijk geannoteerde verbindingen, vermoedelijk gekarakteriseerde klassen van verbindingen en onbekende verbindingen 22 .Op basis van databasezoekopdrachten in Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) werden uiteindelijk biologische verbindingen met MS/MS die overeenkomen met gevalideerde standaarden of exacte matchannotaties in mzCloud (score> 85) of Chemspider geselecteerd als tussenproducten tussen het differentiële metaboloom.Piekannotaties voor elk kenmerk zijn opgenomen in aanvullende gegevens 3. MetaboAnalyst 5.0 werd gebruikt voor univariate analyse van de som-genormaliseerde overvloed aan metabolieten.MetaboAnalyst 5.0 evalueerde ook de verrijkingsanalyse van de KEGG-route op basis van significant verschillende metabolieten.Principale componentenanalyse (PCA) en gedeeltelijke kleinste kwadraten discriminantanalyse (PLS-DA) werden geanalyseerd met behulp van het ropls-softwarepakket (v.1.26.4) met stapelnormalisatie en automatische schaling.Het optimale metabolietbiomarkermodel voor het voorspellen van de maligniteit van knobbeltjes werd gegenereerd met behulp van binaire logistische regressie met de minste absolute krimp en selectie-operator (LASSO, R-pakket v.4.1-3).De prestaties van het discriminantmodel in de detectie- en validatiesets werden gekenmerkt door het schatten van de AUC op basis van ROC-analyse volgens het pROC-pakket (v.1.18.0.).De optimale waarschijnlijkheidsgrens werd verkregen op basis van de maximale Youden-index van het model (gevoeligheid + specificiteit – 1).Monsters met waarden kleiner of groter dan de drempelwaarde worden respectievelijk voorspeld als goedaardige knobbeltjes en longadenocarcinoom.
A549-cellen (#CCL-185, American Type Culture Collection) werden gekweekt in F-12K-medium dat 10% FBS bevatte.Korte haarspeld-RNA-(shRNA)-sequenties gericht op SLC7A5 en een niet-doelgerichte controle (NC) werden in de lentivirale vector pLKO.1-puro ingevoegd.De antisense-sequenties van shSLC7A5 zijn als volgt: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3 '), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Antilichamen tegen SLC7A5 (#5347) en tubuline (#2148) werden gekocht bij Cell Signaling Technology.Antilichamen tegen SLC7A5 en tubuline werden gebruikt in een verdunning van 1:1000 voor Western-blot-analyse.
De Seahorse XF glycolytische stresstest meet de niveaus van extracellulaire verzuring (ECAR).In de test werden glucose, oligomycine A en 2-DG achtereenvolgens toegediend om de cellulaire glycolytische capaciteit te testen, zoals gemeten met ECAR.
A549-cellen getransfecteerd met niet-doelgerichte controle (NC) en shSLC7A5 (Shl, Sh2) werden overnacht uitgeplaat in schalen met een diameter van 10 cm.Celmetabolieten werden geëxtraheerd met 1 ml ijskoude 80% waterige methanol.De cellen in de methanoloplossing werden afgeschraapt, in een nieuwe buis verzameld en gedurende 15 minuten bij 4°C bij 15.000 x g gecentrifugeerd.Verzamel 800 µl supernatant en droog met behulp van een snelle vacuümconcentrator.De gedroogde metabolietpellets werden vervolgens geanalyseerd op tryptofaanniveaus met behulp van LC-MS/MS zoals hierboven beschreven.Cellulaire NAD(H)-niveaus in A549-cellen (NC en shSLC7A5) werden gemeten met behulp van een kwantitatieve NAD+/NADH colorimetrische kit (#K337, BioVision) volgens de instructies van de fabrikant.Voor elk monster werden de eiwitniveaus gemeten om de hoeveelheid metabolieten te normaliseren.
Er zijn geen statistische methoden gebruikt om de steekproefomvang voorlopig te bepalen.Eerdere metabolomics-onderzoeken gericht op de ontdekking van biomarkers15,18 zijn beschouwd als benchmarks voor het bepalen van de grootte, en vergeleken met deze rapporten was onze steekproef voldoende.Er werden geen monsters uitgesloten van het studiecohort.Serummonsters werden willekeurig toegewezen aan een ontdekkingsgroep (306 gevallen, 74,6%) en een interne validatiegroep (104 gevallen, 25,4%) voor niet-gerichte metabolomics-onderzoeken.We hebben ook willekeurig 70 gevallen uit elke groep geselecteerd uit de ontdekkingsset voor gerichte metabolomics-onderzoeken.De onderzoekers waren blind voor groepstoewijzing tijdens het verzamelen en analyseren van LC-MS-gegevens.Statistische analyses van metabolomics-gegevens en celexperimenten worden beschreven in de respectievelijke secties Resultaten, Figuurlegendes en Methoden.Kwantificering van cellulaire tryptofaan-, NADT- en glycolytische activiteit werd driemaal onafhankelijk uitgevoerd met identieke resultaten.
Voor meer informatie over de onderzoeksopzet, zie de Natural Portfolio Report Abstract die bij dit artikel hoort.
De onbewerkte MS-gegevens van de geëxtraheerde kenmerken en de genormaliseerde MS-gegevens van het referentieserum worden respectievelijk weergegeven in Aanvullende Gegevens 1 en Aanvullende Gegevens 2.Piekannotaties voor differentiële kenmerken worden gepresenteerd in aanvullende gegevens 3. De LUAD TCGA-dataset kan worden gedownload van https://portal.gdc.cancer.gov/.De invoergegevens voor het plotten van de grafiek vindt u in de brongegevens.Voor dit artikel worden brongegevens verstrekt.
National Lung Screening Study Group, enz. Het terugdringen van de sterfte aan longkanker met lage dosis computertomografie.Noord-Engeland.J. Med.365, 395-409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR en Prophet, PC Longkankerscreening met behulp van lage dosis spiraalvormige CT: resultaten van de National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Scherm 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Het verminderen van de sterfte aan longkanker met volumetrische CT-screening in een gerandomiseerde studie.Noord-Engeland.J. Med.382, 503–513 (2020).
Posttijd: 18 september 2023