De differentiële diagnose van longnoduli die met computertomografie (CT) zijn geïdentificeerd, blijft een uitdaging in de klinische praktijk. In dit onderzoek karakteriseren we het globale metaboloom van 480 serummonsters, waaronder monsters van gezonde controles, goedaardige longnoduli en longadenocarcinoom in stadium I. Adenocarcinomen vertonen unieke metabolomische profielen, terwijl goedaardige noduli en gezonde individuen een hoge mate van gelijkenis vertonen in metabolomische profielen. In de ontdekkingsgroep (n = 306) werd een set van 27 metabolieten geïdentificeerd die onderscheid maken tussen goedaardige en kwaadaardige noduli. De AUC van het discriminatiemodel in de interne validatiegroep (n = 104) en de externe validatiegroep (n = 111) was respectievelijk 0,915 en 0,945. Pathway-analyse onthulde verhoogde glycolytische metabolieten geassocieerd met verlaagde tryptofaanconcentraties in serum van longadenocarcinoompatiënten in vergelijking met goedaardige noduli en gezonde controles, en suggereerde dat tryptofaanopname de glycolyse in longkankercellen bevordert. Onze studie benadrukt de waarde van serummetabolietbiomarkers bij het inschatten van het risico op longnoduli die met behulp van CT-scans worden gedetecteerd.
Vroege diagnose is cruciaal voor het verbeteren van de overlevingskansen van kankerpatiënten. Resultaten van de Amerikaanse National Lung Cancer Screening Trial (NLST) en de Europese NELSON-studie hebben aangetoond dat screening met lage dosis computertomografie (LDCT) de longkankermortaliteit in risicogroepen significant kan verlagen1,2,3. Sinds het wijdverbreide gebruik van LDCT voor longkankerscreening is de incidentie van asymptomatische longnoduli die per toeval op röntgenfoto's worden gevonden, blijven toenemen4. Longnoduli worden gedefinieerd als focale opaciteiten met een diameter tot 3 cm5. Het is lastig om de waarschijnlijkheid van maligniteit in te schatten en om te gaan met het grote aantal longnoduli dat per toeval op LDCT wordt ontdekt. Beperkingen van CT kunnen leiden tot frequente vervolgonderzoeken en vals-positieve resultaten, met als gevolg onnodige interventies en overbehandeling6. Daarom is er behoefte aan de ontwikkeling van betrouwbare en bruikbare biomarkers om longkanker in een vroeg stadium correct te identificeren en de meeste goedaardige noduli bij de eerste detectie te onderscheiden7.
Uitgebreide moleculaire analyses van bloed (serum, plasma, perifere mononucleaire bloedcellen), waaronder genomica, proteomica en DNA-methylatie8,9,10, hebben geleid tot een groeiende interesse in de ontdekking van diagnostische biomarkers voor longkanker. Tegelijkertijd meten metabolomics-benaderingen cellulaire eindproducten die worden beïnvloed door endogene en exogene acties en worden daarom toegepast om het ontstaan en de uitkomst van de ziekte te voorspellen. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS) is een veelgebruikte methode voor metabolomics-onderzoek vanwege de hoge gevoeligheid en het grote dynamische bereik, waarmee metabolieten met verschillende fysisch-chemische eigenschappen kunnen worden gedetecteerd11,12,13. Hoewel globale metabolomische analyses van plasma/serum zijn gebruikt om biomarkers te identificeren die verband houden met de diagnose van longkanker14,15,16,17 en de effectiviteit van de behandeling,18 moeten serummetabolietclassificaties om onderscheid te maken tussen goedaardige en kwaadaardige longnoduli nog veel worden onderzocht.
Adenocarcinoom en plaveiselcelcarcinoom zijn de twee belangrijkste subtypes van niet-kleincellig longkanker (NSCLC). Verschillende CT-screeningstests wijzen erop dat adenocarcinoom het meest voorkomende histologische type longkanker is1,19,20,21. In deze studie hebben we ultra-performance vloeistofchromatografie-hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gebruikt om metabolomics-analyse uit te voeren op in totaal 695 serummonsters, waaronder monsters van gezonde controles, goedaardige longnoduli en CT-gedetecteerde longadenocarcinomen van ≤3 cm. We hebben een panel van serummetabolieten geïdentificeerd die longadenocarcinoom onderscheiden van goedaardige noduli en gezonde controles. Pathway-verrijkingsanalyse toonde aan dat abnormale tryptofaan- en glucosemetabolisme veelvoorkomende afwijkingen zijn in longadenocarcinoom in vergelijking met goedaardige noduli en gezonde controles. Ten slotte hebben we een serummetabolismeclassificator ontwikkeld en gevalideerd met een hoge specificiteit en sensitiviteit om onderscheid te maken tussen kwaadaardige en goedaardige longnoduli die met LDCT zijn gedetecteerd. Dit kan helpen bij een vroege differentiaaldiagnose en risicobeoordeling.
In de huidige studie werden retrospectief serummonsters verzameld van 174 gezonde controlepersonen, 292 patiënten met benigne longnoduli en 229 patiënten met longadenocarcinoom stadium I, waarbij rekening werd gehouden met geslacht en leeftijd. De demografische kenmerken van de 695 proefpersonen worden weergegeven in aanvullende tabel 1.
Zoals weergegeven in Figuur 1a, werden in totaal 480 serummonsters verzameld in het Kankercentrum van de Sun Yat-sen Universiteit, waaronder 174 monsters van gezonde controlepersonen (HC), 170 monsters van benigne noduli (BN) en 136 monsters van longadenocarcinoom stadium I (LA). Deze monsters vormden een ontdekkingscohort voor ongerichte metabolomische profilering met behulp van ultra-performance vloeistofchromatografie-hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS). Zoals weergegeven in Aanvullende Figuur 1, werden differentiële metabolieten tussen LA en HC, en tussen LA en BN geïdentificeerd om een classificatiemodel op te stellen en verder differentiële pathway-analyse te onderzoeken. 104 monsters verzameld door het Kankercentrum van de Sun Yat-sen Universiteit en 111 monsters verzameld door twee andere ziekenhuizen werden respectievelijk onderworpen aan interne en externe validatie.
a Studiepopulatie in het ontdekkingscohort die een globale serummetabolomics-analyse onderging met behulp van ultra-performance vloeistofchromatografie-hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS). b Partiële kleinste kwadraten discriminantanalyse (PLS-DA) van het totale metaboloom van 480 serummonsters uit het studiecohort, inclusief gezonde controles (HC, n = 174), benigne noduli (BN, n = 170) en stadium I longadenocarcinoom (Los Angeles, n = 136). +ESI, positieve elektrospray-ionisatiemodus, -ESI, negatieve elektrospray-ionisatiemodus. c–e Metabolieten met significant verschillende abundanties in twee gegeven groepen (tweezijdige Wilcoxon signed rank test, p-waarde gecorrigeerd voor false discovery rate, FDR <0,05) worden weergegeven in rood (vouwwijziging > 1,2) en blauw (vouwwijziging < 0,83). ) weergegeven op de vulkaangrafiek. f. Hierarchische clustering-heatmap die significante verschillen laat zien in het aantal geannoteerde metabolieten tussen LA en BN. De brongegevens worden aangeleverd in de vorm van brongegevensbestanden.
Het totale serummetaboloom van 174 HC, 170 BN en 136 LA in de ontdekkingsgroep werd geanalyseerd met behulp van UPLC-HRMS-analyse. We laten eerst zien dat kwaliteitscontrolemonsters (QC-monsters) strak clusteren in het midden van een ongesuperviseerd principal component analysis (PCA)-model, wat de stabiliteit van de prestaties van deze studie bevestigt (aanvullende figuur 2).
Zoals weergegeven in de partiële kleinste kwadraten-discriminatieanalyse (PLS-DA) in figuur 1b, vonden we duidelijke verschillen tussen LA en BN, LA en HC in de positieve (+ESI) en negatieve (−ESI) elektrospray-ionisatiemodi. Er werden echter geen significante verschillen gevonden tussen BN en HC in de +ESI- en -ESI-condities.
We vonden 382 differentiële kenmerken tussen LA en HC, 231 differentiële kenmerken tussen LA en BN, en 95 differentiële kenmerken tussen BN en HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0,05 en multiple change >1,2 of <0,83) (Figuur 1c-e). De pieken werden verder geannoteerd (Aanvullende gegevens 3) aan de hand van een database (mzCloud/HMDB/Chemspider library) op basis van m/z-waarde, retentietijd en fragmentatiemassaspectrum (details beschreven in de sectie Methoden) 22. Uiteindelijk werden 33 en 38 geannoteerde metabolieten met significante verschillen in abundantie geïdentificeerd voor respectievelijk LA versus BN (Figuur 1f en Aanvullende tabel 2) en LA versus HC (Aanvullende figuur 3 en Aanvullende tabel 2). Daarentegen werden er slechts 3 metabolieten met significante verschillen in abundantie geïdentificeerd in BN en HC (aanvullende tabel 2), consistent met de overlap tussen BN en HC in PLS-DA. Deze differentiële metabolieten bestrijken een breed scala aan biochemische stoffen (aanvullende figuur 4). Samengevat tonen deze resultaten significante veranderingen in het serummetaboloom aan die de maligne transformatie van longkanker in een vroeg stadium weerspiegelen, vergeleken met benigne longnoduli of gezonde proefpersonen. Tegelijkertijd suggereert de gelijkenis van het serummetaboloom van BN en HC dat benigne longnoduli veel biologische kenmerken delen met gezonde individuen. Aangezien mutaties in het gen voor de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) veel voorkomen bij longadenocarcinoom subtype 23, wilden we de impact van drijvende mutaties op het serummetaboloom bepalen. Vervolgens analyseerden we het algehele metabolomische profiel van 72 gevallen met EGFR-status in de longadenocarcinoomgroep. Interessant genoeg vonden we vergelijkbare profielen tussen patiënten met een EGFR-mutatie (n = 41) en patiënten met wildtype EGFR (n = 31) in de PCA-analyse (aanvullende figuur 5a). We identificeerden echter 7 metabolieten waarvan de abundantie significant veranderd was bij patiënten met een EGFR-mutatie in vergelijking met patiënten met wildtype EGFR (t-test, p < 0,05 en fold change > 1,2 of < 0,83) (aanvullende figuur 5b). De meerderheid van deze metabolieten (5 van de 7) zijn acylcarnitines, die een belangrijke rol spelen in vetzuuroxidatieprocessen.
Zoals weergegeven in de workflow in Figuur 2a, werden biomarkers voor noduleclassificatie verkregen met behulp van least absolute shrinkage operators en selectie op basis van 33 differentiële metabolieten geïdentificeerd in LA (n = 136) en BN (n = 170). De beste combinatie van variabelen (LASSO) – binair logistisch regressiemodel. Tienvoudige kruisvalidatie werd gebruikt om de betrouwbaarheid van het model te testen. Variabeleselectie en parameterregularisatie werden aangepast door een likelihood maximization penalty met parameter λ24. Globale metabolomics-analyse werd vervolgens onafhankelijk uitgevoerd in de interne validatiegroep (n = 104) en de externe validatiegroep (n = 111) om de classificatieprestaties van het discriminatiemodel te testen. Als resultaat werden 27 metabolieten in de ontdekkingsset geïdentificeerd als het beste discriminatiemodel met de grootste gemiddelde AUC-waarde (Fig. 2b), waarvan 9 een verhoogde activiteit en 18 een verlaagde activiteit vertoonden in LA vergeleken met BN (Fig. 2c).
Werkstroom voor het bouwen van een classificator voor longnoduli, inclusief het selecteren van het beste panel van serummetabolieten in de ontdekkingsset met behulp van een binair logistisch regressiemodel via tienvoudige kruisvalidatie en het evalueren van de voorspellende prestaties in interne en externe validatiesets. b Kruisvalidatiestatistieken van het LASSO-regressiemodel voor de selectie van metabolische biomarkers. De bovenstaande getallen vertegenwoordigen het gemiddelde aantal geselecteerde biomarkers bij een gegeven λ. De rode stippellijn geeft de gemiddelde AUC-waarde weer bij de corresponderende lambda. Grijze foutbalken geven de minimale en maximale AUC-waarden weer. De stippellijn geeft het beste model aan met de 27 geselecteerde biomarkers. AUC, oppervlakte onder de ROC-curve (Receiver Operating Characteristic). c Vouwveranderingen van 27 geselecteerde metabolieten in de LA-groep vergeleken met de BN-groep in de ontdekkingsgroep. Rode kolom – activering. De blauwe kolom is een afname. d–f Receiver operating characteristic (ROC)-curven die de kracht van het discriminatiemodel weergeven, gebaseerd op 27 metabolietcombinaties in de ontdekkings-, interne en externe validatiesets. Brongegevens worden aangeleverd in de vorm van brongegevensbestanden.
Op basis van de gewogen regressiecoëfficiënten van deze 27 metabolieten werd een voorspellingsmodel ontwikkeld (aanvullende tabel 3). ROC-analyse op basis van deze 27 metabolieten leverde een oppervlakte onder de curve (AUC) van 0,933 op, een sensitiviteit van 0,868 voor de ontdekkingsgroep en een specificiteit van 0,859 (figuur 2d). Van de 38 geannoteerde differentiële metabolieten tussen LA en HC behaalde een set van 16 metabolieten een AUC van 0,902 met een sensitiviteit van 0,801 en een specificiteit van 0,856 bij het onderscheiden van LA van HC (aanvullende figuur 6a-c). AUC-waarden op basis van verschillende drempelwaarden voor de vouwverandering van de differentiële metabolieten werden ook vergeleken. We ontdekten dat het classificatiemodel het beste presteerde bij het onderscheiden van LA en BN (HC) wanneer de vouwverandering werd ingesteld op 1,2 in plaats van 1,5 of 2,0 (aanvullende figuur 7a,b). Het classificatiemodel, gebaseerd op 27 metabolietgroepen, werd verder gevalideerd in interne en externe cohorten. De AUC was 0,915 (sensitiviteit 0,867, specificiteit 0,811) voor interne validatie en 0,945 (sensitiviteit 0,810, specificiteit 0,979) voor externe validatie (Fig. 2e, f). Om de interlaboratoriumefficiëntie te beoordelen, werden 40 monsters uit het externe cohort geanalyseerd in een extern laboratorium, zoals beschreven in de sectie Methoden. De classificatienauwkeurigheid bereikte een AUC van 0,925 (Aanvullende figuur 8). Omdat plaveiselcelcarcinoom van de long (LUSC) het op één na meest voorkomende subtype van niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) is na longadenocarcinoom (LUAD), hebben we ook de gevalideerde potentiële bruikbaarheid van metabolische profielen getest. BN en 16 gevallen van LUSC. De AUC voor het onderscheid tussen LUSC en BN was 0,776 (aanvullende figuur 9), wat wijst op een slechter onderscheidingsvermogen in vergelijking met het onderscheid tussen LUAD en BN.
Studies hebben aangetoond dat de grootte van noduli op CT-beelden positief gecorreleerd is met de waarschijnlijkheid van maligniteit en een belangrijke bepalende factor blijft bij de behandeling van noduli25,26,27. Analyse van gegevens uit het grote cohort van de NELSON-screeningstudie toonde aan dat het risico op maligniteit bij personen met noduli <5 mm zelfs vergelijkbaar was met dat bij personen zonder noduli28. Daarom is de minimale grootte die regelmatige CT-monitoring vereist 5 mm, zoals aanbevolen door de British Thoracic Society (BTS), en 6 mm, zoals aanbevolen door de Fleischner Society29. Noduli groter dan 6 mm en zonder duidelijke goedaardige kenmerken, zogenaamde onbepaalde longnoduli (IPN), blijven echter een grote uitdaging bij de evaluatie en behandeling in de klinische praktijk30,31. Vervolgens onderzochten we of de grootte van de nodulus van invloed was op metabolomische kenmerken met behulp van gepoolde monsters uit de ontdekkingscohort en de interne validatiecohort. We hebben ons eerst gericht op 27 gevalideerde biomarkers en de PCA-profielen van de metabolomen van HC- en BN-noduli kleiner dan 6 mm vergeleken. We ontdekten dat de meeste datapunten voor HC en BN elkaar overlapten, wat aantoont dat de serummetabolietniveaus in beide groepen vergelijkbaar waren (Fig. 3a). De feature maps over verschillende groottes bleven behouden in BN en LA (Fig. 3b, c), terwijl er een scheiding werd waargenomen tussen maligne en benigne noduli in het bereik van 6-20 mm (Fig. 3d). Deze cohort had een AUC van 0,927, een specificiteit van 0,868 en een sensitiviteit van 0,820 voor het voorspellen van de maligniteit van noduli met een afmeting van 6 tot 20 mm (Fig. 3e, f). Onze resultaten tonen aan dat de classifier metabolische veranderingen kan detecteren die worden veroorzaakt door vroege maligne transformatie, ongeacht de grootte van de nodulus.
a Vergelijking van PCA-profielen tussen gespecificeerde groepen op basis van een metabolische classificator van 27 metabolieten. CC en BN < 6 mm. b BN < 6 mm versus BN 6–20 mm. in LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm en LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Receiver operating characteristic (ROC)-curve die de prestaties van het discriminatiemodel voor noduli van 6–20 mm weergeeft. f Waarschijnlijkheidswaarden werden berekend op basis van het logistische regressiemodel voor noduli van 6–20 mm. De grijze stippellijn geeft de optimale grenswaarde (0,455) weer. De bovenstaande cijfers geven het verwachte percentage gevallen voor Los Angeles weer. Gebruik een tweezijdige t-toets van Student. PCA staat voor principale componentenanalyse. AUC staat voor oppervlakte onder de curve. De brongegevens worden aangeleverd in de vorm van brongegevensbestanden.
Vier monsters (leeftijd 44-61 jaar) met vergelijkbare longnoduli (7-9 mm) werden verder geselecteerd om de prestaties van het voorgestelde model voor maligniteitsvoorspelling te illustreren (Fig. 4a, b). Bij de eerste screening presenteerde patiënt 1 zich als een solide nodule met verkalking, een kenmerk dat geassocieerd wordt met benigniteit, terwijl patiënt 2 zich presenteerde als een onduidelijke, gedeeltelijk solide nodule zonder duidelijke benigne kenmerken. Drie rondes follow-up CT-scans toonden aan dat deze gevallen gedurende een periode van 4 jaar stabiel bleven en daarom als benigne noduli werden beschouwd (Fig. 4a). In vergelijking met klinische evaluatie van seriële CT-scans identificeerde eenmalige serummetabolietenanalyse met het huidige classificatiemodel deze benigne noduli snel en correct op basis van probabilistische beperkingen (Tabel 1). Figuur 4b in patiënt 3 toont een nodule met tekenen van pleurale retractie, wat meestal geassocieerd wordt met maligniteit32. Casus 4 presenteerde zich als een onduidelijke, gedeeltelijk solide nodule zonder aanwijzingen voor een goedaardige oorzaak. Al deze gevallen werden door het classificatiemodel als kwaadaardig voorspeld (Tabel 1). De diagnose longadenocarcinoom werd bevestigd door histopathologisch onderzoek na longresectie (Fig. 4b). Voor de externe validatieset voorspelde de metabolische classifier twee gevallen van onduidelijke longnodules groter dan 6 mm correct (Aanvullende figuur 10).
CT-beelden van de axiale doorsnede van de longen van twee gevallen van benigne noduli. In geval 1 toonde een CT-scan na 4 jaar een stabiele, solide nodule van 7 mm met verkalking in de rechter onderkwab. In geval 2 toonde een CT-scan na 5 jaar een stabiele, deels solide nodule met een diameter van 7 mm in de rechter bovenkwab. b Axiale CT-beelden van de longen en bijbehorende pathologische onderzoeken van twee gevallen van stadium I adenocarcinoom vóór longresectie. In geval 3 werd een nodule met een diameter van 8 mm in de rechter bovenkwab met pleurale retractie gevonden. In geval 4 werd een deels solide, matglasachtige nodule van 9 mm in de linker bovenkwab gevonden. Hematoxyline-eosine (H&E)-kleuring van geresecteerd longweefsel (schaalstreep = 50 μm) toont het acinaire groeipatroon van longadenocarcinoom. Pijlen geven de op de CT-beelden gedetecteerde noduli aan. H&E-afbeeldingen zijn representatieve afbeeldingen van meerdere (>3) microscopische velden die door de patholoog zijn onderzocht.
Samengevat tonen onze resultaten de potentiële waarde aan van serummetabolietbiomarkers bij de differentiaaldiagnose van longnoduli, wat een uitdaging kan vormen bij de evaluatie van CT-screening.
Op basis van een gevalideerd differentieel metabolietenpanel probeerden we biologische correlaten van belangrijke metabole veranderingen te identificeren. KEGG-pathway-verrijkingsanalyse met MetaboAnalyst identificeerde 6 gemeenschappelijke, significant veranderde pathways tussen de twee gegeven groepen (LA vs. HC en LA vs. BN, aangepaste p ≤ 0,001, effect > 0,01). Deze veranderingen werden gekenmerkt door verstoringen in het pyruvaatmetabolisme, tryptofaanmetabolisme, niacine- en nicotinamidemetabolisme, glycolyse, de TCA-cyclus en purinemetabolisme (Fig. 5a). Vervolgens voerden we gerichte metabolomics uit om de belangrijkste veranderingen te verifiëren met behulp van absolute kwantificering. Bepaling van gemeenschappelijke metabolieten in gemeenschappelijk veranderde pathways door middel van triple quadrupole massaspectrometrie (QQQ) met behulp van authentieke metabolietstandaarden. De demografische kenmerken van de doelsteekproef van het metabolomics-onderzoek zijn opgenomen in aanvullende tabel 4. In overeenstemming met onze globale metabolomics-resultaten bevestigde de kwantitatieve analyse dat hypoxanthine en xanthine, pyruvaat en lactaat verhoogd waren in LA vergeleken met BN en HC (Fig. 5b, c, p <0,05). Er werden echter geen significante verschillen in deze metabolieten gevonden tussen BN en HC.
KEGG-pathway-verrijkingsanalyse van significant verschillende metabolieten in de LA-groep vergeleken met de BN- en HC-groepen. Er werd een tweezijdige Globaltest gebruikt en de p-waarden werden gecorrigeerd met de Holm-Bonferroni-methode (gecorrigeerde p ≤ 0,001 en effectgrootte > 0,01). b–d Vioolplots die de niveaus van hypoxanthine, xanthine, lactaat, pyruvaat en tryptofaan in serum van HC, BN en LA weergeven, bepaald met LC-MS/MS (n = 70 per groep). Witte en zwarte stippellijnen geven respectievelijk de mediaan en het kwartiel aan. e Vioolplot die de genormaliseerde Log2TPM (transcripten per miljoen) mRNA-expressie van SLC7A5 en QPRT in longadenocarcinoom (n = 513) weergeeft, vergeleken met normaal longweefsel (n = 59) in de LUAD-TCGA-dataset. Het witte kader geeft de interkwartielafstand weer, de horizontale zwarte lijn in het midden de mediaan en de verticale zwarte lijn vanuit het kader het 95% betrouwbaarheidsinterval (BI). f Pearson-correlatiegrafiek van de expressie van SLC7A5 en GAPDH in longadenocarcinoom (n = 513) en normaal longweefsel (n = 59) in de TCGA-dataset. Het grijze gebied geeft het 95% BI weer. r, Pearson-correlatiecoëfficiënt. g Genormaliseerde cellulaire tryptofaanniveaus in A549-cellen getransfecteerd met niet-specifieke shRNA-controle (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2), bepaald met LC-MS/MS. Statistische analyse van vijf biologisch onafhankelijke monsters in elke groep wordt gepresenteerd. h Cellulaire niveaus van NADt (totaal NAD, inclusief NAD+ en NADH) in A549-cellen (NC) en SLC7A5-knockdown A549-cellen (Sh1, Sh2). Statistische analyse van drie biologisch onafhankelijke monsters in elke groep wordt gepresenteerd. i De glycolytische activiteit van A549-cellen vóór en na SLC7A5-knockdown werd gemeten aan de hand van de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) (n = 4 biologisch onafhankelijke monsters per groep). 2-DG, 2-deoxy-D-glucose. In (b–h) werd een tweezijdige Student's t-test gebruikt. In (g–i) geven de foutbalken het gemiddelde ± SD weer; elk experiment werd driemaal onafhankelijk uitgevoerd en de resultaten waren vergelijkbaar. Brongegevens worden aangeleverd in de vorm van brongegevensbestanden.
Gezien de significante impact van een verstoord tryptofaanmetabolisme in de LA-groep, hebben we ook de serumtryptofaanspiegels in de HC-, BN- en LA-groepen gemeten met behulp van QQQ. We vonden dat de serumtryptofaanspiegel in de LA-groep lager was dan in de HC- of BN-groep (p < 0,001, Figuur 5d), wat consistent is met eerdere bevindingen dat de circulerende tryptofaanspiegels lager zijn bij patiënten met longkanker dan bij gezonde controles uit de controlegroep33,34,35. Een andere studie met de PET/CT-tracer 11C-methyl-L-tryptofaan toonde aan dat de retentietijd van het tryptofaansignaal in longkankerweefsel significant langer was dan in goedaardige laesies of normaal weefsel36. We veronderstellen dat de afname van tryptofaan in het serum van de LA-groep een weerspiegeling kan zijn van actieve tryptofaanopname door longkankercellen.
Het is ook bekend dat het eindproduct van de kynurenine-route van tryptofaankatabolisme NAD+ is37,38, een belangrijk substraat voor de reactie van glyceraldehyde-3-fosfaat met 1,3-bisfosfoglyceraat in de glycolyse39. Terwijl eerdere studies zich hebben gericht op de rol van tryptofaankatabolisme in immuunregulatie, wilden we in deze studie de wisselwerking tussen tryptofaandysregulatie en glycolytische routes ophelderen. Solute transporter family 7 member 5 (SLC7A5) staat bekend als een tryptofaantransporter43,44,45. Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) is een enzym dat zich stroomafwaarts van de kynurenine-route bevindt en chinolinezuur omzet in NAMN46. Inspectie van de LUAD TCGA-dataset toonde aan dat zowel SLC7A5 als QPRT significant verhoogd waren in tumorweefsel vergeleken met normaal weefsel (Fig. 5e). Deze toename werd waargenomen in zowel stadium I en II als stadium III en IV van longadenocarcinoom (aanvullende figuur 11), wat wijst op vroege verstoringen in het tryptofaanmetabolisme die samenhangen met tumorvorming.
Bovendien toonde de LUAD-TCGA-dataset een positieve correlatie tussen de mRNA-expressie van SLC7A5 en GAPDH in monsters van kankerpatiënten (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figuur 5f). Daarentegen werd geen significante correlatie gevonden tussen deze genexpressieprofielen in normaal longweefsel (r = 0,25, p = 0,06, Figuur 5f). Knockdown van SLC7A5 (Aanvullende Figuur 12) in A549-cellen verminderde de cellulaire tryptofaan- en NAD(H)-niveaus significant (Figuur 5g,h), wat resulteerde in een verzwakte glycolytische activiteit, gemeten aan de hand van de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) (Figuur 1i). Op basis van de metabolische veranderingen in serum en in vitro-detectie veronderstellen we daarom dat het tryptofaanmetabolisme NAD+ kan produceren via de kynurenineroute en een belangrijke rol kan spelen bij het bevorderen van de glycolyse bij longkanker.
Uit onderzoek is gebleken dat een groot aantal onduidelijke longnodules die met LDCT worden gedetecteerd, kan leiden tot de noodzaak van aanvullende onderzoeken zoals PET-CT, longbiopsie en overbehandeling als gevolg van een vals-positieve diagnose van maligniteit.31 Zoals weergegeven in figuur 6, heeft onze studie een panel van serummetabolieten geïdentificeerd met potentiële diagnostische waarde die de risicostratificatie en het daaropvolgende management van met CT gedetecteerde longnodules kunnen verbeteren.
Longnoduli worden beoordeeld met behulp van lage dosis computertomografie (LDCT), waarbij beeldkenmerken wijzen op een goedaardige of kwaadaardige oorzaak. De onzekere prognose van noduli kan leiden tot frequente controlebezoeken, onnodige ingrepen en overbehandeling. Het gebruik van serummetabole classificaties met diagnostische waarde kan de risicobeoordeling en de daaropvolgende behandeling van longnoduli verbeteren. PET staat voor positronemissietomografie.
Gegevens uit de Amerikaanse NLST-studie en de Europese NELSON-studie suggereren dat screening van risicogroepen met lage dosis computertomografie (LDCT) de longkankermortaliteit kan verminderen1,3. De risicobeoordeling en de daaropvolgende klinische behandeling van grote aantallen toevallig ontdekte longnoduli met behulp van LDCT blijven echter de grootste uitdaging. Het belangrijkste doel is om de correcte classificatie van bestaande LDCT-protocollen te optimaliseren door betrouwbare biomarkers te integreren.
Bepaalde moleculaire biomarkers, zoals bloedmetabolieten, zijn geïdentificeerd door longkanker te vergelijken met gezonde controles15,17. In deze studie richtten we ons op de toepassing van serummetabolomics-analyse om onderscheid te maken tussen goedaardige en kwaadaardige longnoduli die incidenteel werden gedetecteerd met behulp van LDCT. We vergeleken het globale serummetaboloom van gezonde controles (HC), goedaardige longnoduli (BN) en longadenocarcinoom in stadium I (LA) met behulp van UPLC-HRMS-analyse. We ontdekten dat HC en BN vergelijkbare metabolische profielen hadden, terwijl LA significante veranderingen vertoonde in vergelijking met HC en BN. We identificeerden twee sets serummetabolieten die LA onderscheiden van HC en BN.
Het huidige op LDCT gebaseerde identificatieschema voor benigne en maligne noduli is voornamelijk gebaseerd op de grootte, dichtheid, morfologie en groeisnelheid van de noduli in de loop van de tijd30. Eerdere studies hebben aangetoond dat de grootte van de noduli nauw verband houdt met de kans op longkanker. Zelfs bij patiënten met een hoog risico is het risico op maligniteit bij noduli kleiner dan 6 mm minder dan 1%. Het risico op maligniteit voor noduli met een diameter van 6 tot 20 mm varieert van 8% tot 64%30. Daarom adviseert de Fleischner Society een grenswaarde van 6 mm voor routinematige CT-follow-up.29 De risicobeoordeling en het management van onbepaalde longnoduli (IPN) groter dan 6 mm zijn echter nog niet adequaat uitgevoerd31. Het huidige management van aangeboren hartafwijkingen is doorgaans gebaseerd op afwachtend beleid met frequente CT-monitoring.
Op basis van het gevalideerde metaboloom hebben we voor het eerst de overlap aangetoond tussen metabolomische signaturen van gezonde individuen en benigne noduli <6 mm. De biologische gelijkenis is consistent met eerdere CT-bevindingen dat het risico op maligniteit voor noduli <6 mm even laag is als voor personen zonder noduli.30 Het is belangrijk op te merken dat onze resultaten ook aantonen dat benigne noduli <6 mm en ≥6 mm een grote gelijkenis vertonen in metabolomische profielen, wat suggereert dat de functionele definitie van benigne etiologie consistent is, ongeacht de grootte van de nodule. Moderne diagnostische serummetabolietenpanels kunnen dus een enkele test bieden als uitsluitingstest wanneer noduli initieel worden gedetecteerd op CT en mogelijk de noodzaak tot herhaalde monitoring verminderen. Tegelijkertijd onderscheidde hetzelfde panel van metabolische biomarkers maligne noduli ≥6 mm van benigne noduli en leverde het nauwkeurige voorspellingen voor IPN's van vergelijkbare grootte en met ambigue morfologische kenmerken op CT-beelden. Deze serummetabolismeclassificator presteerde goed in het voorspellen van de maligniteit van noduli ≥6 mm met een AUC van 0,927. Samengevat wijzen onze resultaten erop dat unieke serummetabolomische signaturen specifiek vroege, door tumoren geïnduceerde metabolische veranderingen kunnen weerspiegelen en potentieel waardevol kunnen zijn als risicovoorspellers, onafhankelijk van de grootte van de nodulus.
Opvallend is dat longadenocarcinoom (LUAD) en plaveiselcelcarcinoom (LUSC) de belangrijkste typen niet-kleincellige longkanker (NSCLC) zijn. Aangezien LUSC sterk geassocieerd is met tabaksgebruik47 en LUAD de meest voorkomende histologie is van toevallig ontdekte longnoduli bij CT-screening48, is ons classificatiemodel specifiek ontwikkeld voor adenocarcinoommonsters in stadium I. Wang en collega's richtten zich ook op LUAD en identificeerden negen lipideprofielen met behulp van lipidomics om longkanker in een vroeg stadium te onderscheiden van gezonde individuen17. We hebben het huidige classificatiemodel getest op 16 gevallen van LUSC in stadium I en 74 goedaardige noduli en observeerden een lage voorspellingsnauwkeurigheid voor LUSC (AUC 0,776), wat suggereert dat LUAD en LUSC mogelijk hun eigen metabolomische profielen hebben. Er is inderdaad aangetoond dat LUAD en LUSC verschillen in etiologie, biologische oorsprong en genetische afwijkingen49. Daarom moeten ook andere histologische typen worden opgenomen in trainingsmodellen voor populatiegerichte detectie van longkanker in screeningsprogramma's.
Hier hebben we de zes meest frequent veranderde pathways in longadenocarcinoom geïdentificeerd in vergelijking met gezonde controles en benigne noduli. Xanthine en hypoxanthine zijn veelvoorkomende metabolieten van de purinemetabolische pathway. In overeenstemming met onze resultaten waren intermediairen geassocieerd met purinemetabolisme significant verhoogd in het serum of weefsel van patiënten met longadenocarcinoom in vergelijking met gezonde controles of patiënten in het pre-invasieve stadium15,50. Verhoogde serumspiegels van xanthine en hypoxanthine kunnen de anabolisme weerspiegelen die nodig is voor snel prolifererende kankercellen. Dysregulatie van het glucosemetabolisme is een bekend kenmerk van kankermetabolisme51. Hier observeerden we een significante toename van pyruvaat en lactaat in de LA-groep in vergelijking met de HC- en BN-groep, wat consistent is met eerdere rapporten over afwijkingen in de glycolytische pathway in de serummetaboloomprofielen van patiënten met niet-kleincellige longkanker (NSCLC) en gezonde controles. De resultaten zijn consistent52,53.
Belangrijk is dat we een omgekeerde correlatie observeerden tussen pyruvaat- en tryptofaanmetabolisme in het serum van longadenocarcinomen. De serumtryptofaanspiegels waren verlaagd in de LA-groep vergeleken met de HC- of BN-groep. Interessant is dat een eerdere grootschalige studie met een prospectieve cohort aantoonde dat lage circulerende tryptofaanspiegels geassocieerd waren met een verhoogd risico op longkanker 54. Tryptofaan is een essentieel aminozuur dat we volledig uit voeding halen. We concluderen dat de afname van serumtryptofaan bij longadenocarcinoom een snelle afname van deze metaboliet kan weerspiegelen. Het is bekend dat het eindproduct van tryptofaankatabolisme via de kynurenineroute de bron is van de novo NAD+-synthese. Omdat NAD+ voornamelijk via de salvageroute wordt geproduceerd, moet het belang van NAD+ in het tryptofaanmetabolisme in gezondheid en ziekte nog worden vastgesteld46. Onze analyse van de TCGA-database toonde aan dat de expressie van de tryptofaantransporter solute transporter 7A5 (SLC7A5) significant verhoogd was in longadenocarcinoom vergeleken met normale controles en positief gecorreleerd was met de expressie van het glycolytische enzym GAPDH. Eerdere studies hebben zich voornamelijk gericht op de rol van tryptofaankatabolisme bij het onderdrukken van de antitumorale immuunrespons40,41,42. Hier tonen we aan dat remming van de tryptofaanopname door knockdown van SLC7A5 in longkankercellen resulteert in een daaropvolgende afname van de cellulaire NAD-niveaus en een gelijktijdige verzwakking van de glycolytische activiteit. Samenvattend biedt onze studie een biologische basis voor veranderingen in het serummetabolisme die gepaard gaan met maligne transformatie van longadenocarcinoom.
EGFR-mutaties zijn de meest voorkomende drijvende mutaties bij patiënten met NSCLC. In onze studie vonden we dat patiënten met een EGFR-mutatie (n = 41) over het algemeen vergelijkbare metabolomische profielen hadden als patiënten met wildtype EGFR (n = 31), hoewel we verlaagde serumspiegels van acylcarnitine vonden bij sommige patiënten met een EGFR-mutatie. De bekende functie van acylcarnitines is het transporteren van acylgroepen vanuit het cytoplasma naar de mitochondriale matrix, wat leidt tot de oxidatie van vetzuren om energie te produceren 55. In overeenstemming met onze bevindingen identificeerde een recente studie ook vergelijkbare metaboloomprofielen tussen EGFR-mutante en EGFR-wildtype tumoren door het globale metaboloom van 102 longadenocarcinoomweefselmonsters te analyseren50. Interessant genoeg werd ook acylcarnitine aangetroffen in de EGFR-mutante groep. Daarom is verder onderzoek naar de vraag of veranderingen in acylcarnitinespiegels EGFR-geïnduceerde metabolische veranderingen en de onderliggende moleculaire routes weerspiegelen, de moeite waard.
Samenvattend stelt ons onderzoek een serummetabolismeclassificatiesysteem vast voor de differentiële diagnose van longnoduli en stelt een workflow voor die de risicobeoordeling kan optimaliseren en het klinisch management kan vergemakkelijken op basis van CT-scanscreening.
Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Sun Yat-sen University Cancer Center, het First Affiliated Hospital van de Sun Yat-sen Universiteit en de ethische commissie van het Zhengzhou University Cancer Hospital. In de ontdekkings- en interne validatiegroepen werden 174 serummonsters van gezonde personen en 244 serummonsters van personen met goedaardige knobbeltjes verzameld tijdens hun jaarlijkse medische controle op de afdeling Kankerbestrijding en -preventie van het Sun Yat-sen University Cancer Center. Daarnaast werden 166 serummonsters van goedaardige knobbeltjes (stadium I longadenocarcinoom) verzameld van het Sun Yat-sen University Cancer Center. In de externe validatiecohort waren er 48 gevallen van goedaardige knobbeltjes, 39 gevallen van stadium I longadenocarcinoom van het First Affiliated Hospital van de Sun Yat-sen Universiteit en 24 gevallen van stadium I longadenocarcinoom van het Zhengzhou Cancer Hospital. Het Sun Yat-sen University Cancer Center verzamelde ook 16 gevallen van plaveiselcelcarcinoom van de long in stadium I om het diagnostisch vermogen van de ontwikkelde metabolische classificator te testen (patiëntkenmerken worden weergegeven in Aanvullende Tabel 5). Monsters voor het ontdekkingscohort en het interne validatiecohort werden verzameld tussen januari 2018 en mei 2020. Monsters voor het externe validatiecohort werden verzameld tussen augustus 2021 en oktober 2022. Om genderbias te minimaliseren, werden ongeveer evenveel mannelijke als vrouwelijke gevallen aan elk cohort toegewezen. Ontdekkingsteam en intern beoordelingsteam. Het geslacht van de deelnemers werd vastgesteld op basis van zelfrapportage. Van alle deelnemers werd informed consent verkregen en er werd geen vergoeding verstrekt. Patiënten met benigne noduli waren degenen met een stabiele CT-scanscore gedurende 2 tot 5 jaar op het moment van analyse, met uitzondering van 1 geval uit de externe validatiesteekproef, dat preoperatief werd verzameld en histopathologisch werd gediagnosticeerd. Met uitzondering van chronische bronchitis. Longadenocarcinoomgevallen werden verzameld vóór longresectie en bevestigd door pathologische diagnose. Nuchtere bloedmonsters werden afgenomen in serumscheidingsbuizen zonder anticoagulantia. De bloedmonsters werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gestold en vervolgens gedurende 10 minuten bij 2851 × g gecentrifugeerd bij 4 °C om het serumsupernatant te verkrijgen. Serumaliquots werden ingevroren bij -80 °C tot de extractie van metabolieten. De afdeling Kankerpreventie en Medisch Onderzoek van het Kankercentrum van de Sun Yat-sen Universiteit verzamelde een serumpool van 100 gezonde donoren, waaronder een gelijk aantal mannen en vrouwen in de leeftijd van 40 tot 55 jaar. Gelijke volumes van elk donormonster werden gemengd, de resulterende pool werd in aliquots verdeeld en bewaard bij -80 °C. Het serummengsel werd gebruikt als referentiemateriaal voor kwaliteitscontrole en datastandaardisatie.
Referentieserum en testmonsters werden ontdooid en metabolieten werden geëxtraheerd met behulp van een gecombineerde extractiemethode (MTBE/methanol/water) 56. Kort gezegd werd 50 μl serum gemengd met 225 μl ijskoud methanol en 750 μl ijskoud methyl-tert-butylether (MTBE). Het mengsel werd geroerd en gedurende 1 uur op ijs geïncubeerd. De monsters werden vervolgens gemengd en met een vortexmixer gemengd met 188 μl MS-kwaliteit water dat interne standaarden bevatte (13C-lactaat, 13C3-pyruvaat, 13C-methionine en 13C6-isoleucine, gekocht bij Cambridge Isotope Laboratories). Het mengsel werd vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd met 15.000 × g, en de onderste fase werd overgebracht naar twee buizen (elk 125 μl) voor LC-MS-analyse in positieve en negatieve modus. Ten slotte werd het monster in een hogesnelheidsvacuümconcentrator tot droogte verdampt.
De gedroogde metabolieten werden opgelost in 120 μl 80% acetonitril, gedurende 5 min gevortexd en vervolgens gedurende 10 min bij 15.000 × g gecentrifugeerd bij 4°C. De supernatanten werden overgebracht naar amberkleurige glazen flesjes met micro-inserts voor metabolomics-onderzoek. Ongefocuste metabolomics-analyse werd uitgevoerd op een ultra-performance vloeistofchromatografie-hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) platform. Metabolieten werden gescheiden met behulp van een Dionex Ultimate 3000 UPLC-systeem en een ACQUITY BEH Amide-kolom (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). In de positieve ionenmodus bestonden de mobiele fasen uit 95% (A) en 50% acetonitril (B), elk met 10 mmol/l ammoniumacetaat en 0,1% mierenzuur. In de negatieve modus bevatten de mobiele fasen A en B respectievelijk 95% en 50% acetonitril. Beide fasen bevatten 10 mmol/L ammoniumacetaat, pH = 9. Het gradiëntprogramma was als volgt: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. De kolomtemperatuur werd op 40 °C gehouden en het monster op 10 °C in de autosampler. De stroomsnelheid was 0,3 ml/min en het injectievolume was 3 μl. Een Q-Exactive Orbitrap massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific) met een elektrospray-ionisatie (ESI) bron werd gebruikt in de full scan-modus en gekoppeld aan de ddMS2-monitoringmodus om grote hoeveelheden data te verzamelen. De MS-parameters werden als volgt ingesteld: spuitspanning +3,8 kV/- 3,2 kV, capillaire temperatuur 320 °C, beschermgas 40 arb, hulpgas 10 arb, temperatuur van de probeverwarming 350 °C, scanbereik 70–1050 m/u, resolutie 70.000. De data werden verzameld met behulp van Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Om de datakwaliteit te beoordelen, werden gepoolde kwaliteitscontrolemonsters (QC-monsters) gegenereerd door 10 μL aliquots van het supernatant uit elk monster te verwijderen. Zes injecties met kwaliteitscontrolemonsters werden aan het begin van de analytische sequentie geanalyseerd om de stabiliteit van het UPLC-MS-systeem te beoordelen. Vervolgens werden periodiek kwaliteitscontrolemonsters aan de batch toegevoegd. Alle 11 batches serummonsters in deze studie werden geanalyseerd met LC-MS. Aliquots van een serumpoolmengsel van 100 gezonde donoren werden in de respectievelijke batches gebruikt als referentiemateriaal om het extractieproces te monitoren en te corrigeren voor batch-tot-batch-effecten. Ongegerichte metabolomics-analyse van het ontdekkingscohort, het interne validatiecohort en het externe validatiecohort werd uitgevoerd in het Metabolomics Center van de Sun Yat-sen Universiteit. Het externe laboratorium van het Analyse- en Testcentrum van de Guangdong Universiteit van Technologie analyseerde ook 40 monsters uit het externe cohort om de prestaties van het classificatiemodel te testen.
Na extractie en reconstitutie werd de absolute kwantificering van serummetabolieten gemeten met behulp van ultra-high performance vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (Agilent 6495 triple quadrupool) met een elektrospray-ionisatie (ESI) bron in multiple reaction monitoring (MRM) modus. Een ACQUITY BEH Amide kolom (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) werd gebruikt om de metabolieten te scheiden. De mobiele fase bestond uit 90% (A) en 5% acetonitril (B) met 10 mmol/L ammoniumacetaat en 0,1% ammoniakoplossing. Het gradiëntprogramma was als volgt: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0% B. De kolomtemperatuur werd op 40 °C gehouden en het monster op 10 °C in de autosampler. De stroomsnelheid bedroeg 0,3 ml/min en het injectievolume was 1 μl. De MS-parameters werden als volgt ingesteld: capillaire spanning ±3,5 kV, vernevelingsdruk 35 psi, stroomsnelheid van het omhullende gas 12 l/min, temperatuur van het omhullende gas 350 °C, temperatuur van het drooggas 250 °C en stroomsnelheid van het drooggas 14 l/min. De MRM-conversies van tryptofaan, pyruvaat, lactaat, hypoxanthine en xanthine waren respectievelijk 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 en 151,0–107,9. De gegevens werden verzameld met behulp van Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Voor serummonsters werden tryptofaan, pyruvaat, lactaat, hypoxanthine en xanthine gekwantificeerd met behulp van kalibratiecurves van standaardmengsels. Voor celmonsters werd het tryptofaangehalte genormaliseerd ten opzichte van de interne standaard en de celproteïnemassa.
De piekextractie (m/z en retentietijd (RT)) werd uitgevoerd met behulp van Compound Discovery 3.1 en TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Om potentiële verschillen tussen batches te elimineren, werd elke karakteristieke piek van het testmonster gedeeld door de karakteristieke piek van het referentiemateriaal uit dezelfde batch om de relatieve abundantie te verkrijgen. De relatieve standaarddeviaties van de interne standaarden vóór en na standaardisatie worden weergegeven in Aanvullende Tabel 6. Verschillen tussen de twee groepen werden gekarakteriseerd door de false discovery rate (FDR<0,05, Wilcoxon signed rank test) en de fold change (>1,2 of <0,83). Ruwe MS-gegevens van de geëxtraheerde kenmerken en referentie-serum-gecorrigeerde MS-gegevens worden respectievelijk weergegeven in Aanvullende Gegevens 1 en Aanvullende Gegevens 2. Piekannotatie werd uitgevoerd op basis van vier gedefinieerde identificatieniveaus, waaronder geïdentificeerde metabolieten, vermoedelijk geannoteerde verbindingen, vermoedelijk gekarakteriseerde verbindingklassen en onbekende verbindingen 22. Op basis van databasezoekopdrachten in Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) werden biologische verbindingen met MS/MS-matches van gevalideerde standaarden of exacte match-annotaties in mzCloud (score > 85) of Chemspider uiteindelijk geselecteerd als intermediairen in het differentiële metaboloom. Piekannotaties voor elk kenmerk zijn opgenomen in Aanvullende Gegevens 3. MetaboAnalyst 5.0 werd gebruikt voor univariate analyse van de genormaliseerde abundantie van metabolieten. MetaboAnalyst 5.0 evalueerde ook KEGG-pathway-verrijkingsanalyse op basis van significant verschillende metabolieten. Hoofdcomponentenanalyse (PCA) en partiële kleinste kwadraten discriminantanalyse (PLS-DA) werden geanalyseerd met behulp van het ropls-softwarepakket (v.1.26.4) met stacknormalisatie en autoscaling. Het optimale metabolietbiomarkermodel voor het voorspellen van de maligniteit van noduli werd gegenereerd met behulp van binaire logistische regressie met de least absolute shrinkage and selection operator (LASSO, R-pakket v.4.1-3). De prestatie van het discriminantmodel in de detectie- en validatiesets werd gekarakteriseerd door de AUC te schatten op basis van ROC-analyse met behulp van het pROC-pakket (v.1.18.0). De optimale waarschijnlijkheidsdrempel werd verkregen op basis van de maximale Youden-index van het model (sensitiviteit + specificiteit – 1). Monsters met waarden lager dan de drempelwaarde worden voorspeld als goedaardige noduli en longadenocarcinoom.
A549-cellen (#CCL-185, American Type Culture Collection) werden gekweekt in F-12K-medium met 10% FBS. Korte hairpin-RNA (shRNA)-sequenties gericht op SLC7A5 en een niet-gerichte controle (NC) werden ingevoegd in de lentivirale vector pLKO.1-puro. De antisense-sequenties van shSLC7A5 zijn als volgt: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antilichamen tegen SLC7A5 (#5347) en tubuline (#2148) werden aangeschaft bij Cell Signaling Technology. Antilichamen tegen SLC7A5 en tubuline werden gebruikt in een verdunning van 1:1000 voor Western blot-analyse.
De Seahorse XF Glycolytische Stresstest meet de extracellulaire verzuring (ECAR). Bij deze test werden glucose, oligomycine A en 2-DG achtereenvolgens toegediend om de cellulaire glycolytische capaciteit te testen, zoals gemeten door ECAR.
A549-cellen getransfecteerd met een niet-gerichte controle (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2) werden een nacht gekweekt in schalen met een diameter van 10 cm. Celmetabolieten werden geëxtraheerd met 1 ml ijskoud 80% waterig methanol. De cellen in de methanoloplossing werden losgeschraapt, verzameld in een nieuwe buis en gecentrifugeerd bij 15.000 × g gedurende 15 minuten bij 4°C. Verzamel 800 µl supernatant en droog dit met behulp van een hogesnelheidsvacuümconcentrator. De gedroogde metabolietenpellets werden vervolgens geanalyseerd op tryptofaanniveaus met behulp van LC-MS/MS zoals hierboven beschreven. De cellulaire NAD(H)-niveaus in A549-cellen (NC en shSLC7A5) werden gemeten met behulp van een kwantitatieve NAD+/NADH-colorimetrische kit (#K337, BioVision) volgens de instructies van de fabrikant. Eiwitniveaus werden voor elk monster gemeten om de hoeveelheid metabolieten te normaliseren.
Er werden geen statistische methoden gebruikt om de steekproefomvang vooraf te bepalen. Eerdere metabolomics-studies gericht op de ontdekking van biomarkers15,18 zijn als referentiepunten voor de bepaling van de steekproefomvang beschouwd, en vergeleken met deze rapporten was onze steekproef adequaat. Er werden geen monsters uit het cohort uitgesloten. Serummonsters werden willekeurig toegewezen aan een ontdekkingsgroep (306 gevallen, 74,6%) en een interne validatiegroep (104 gevallen, 25,4%) voor ongerichte metabolomics-studies. We selecteerden ook willekeurig 70 gevallen uit elke groep uit de ontdekkingsset voor gerichte metabolomics-studies. De onderzoekers waren niet op de hoogte van de groepstoewijzing tijdens de LC-MS-gegevensverzameling en -analyse. Statistische analyses van metabolomics-gegevens en cel-experimenten worden beschreven in de respectievelijke secties Resultaten, Figuuronderschriften en Methoden. Kwantificering van cellulair tryptofaan, NADT en glycolytische activiteit werd driemaal onafhankelijk uitgevoerd met identieke resultaten.
Voor meer informatie over het onderzoeksontwerp, zie de samenvatting van het Natural Portfolio Report die bij dit artikel hoort.
De ruwe MS-gegevens van de geëxtraheerde kenmerken en de genormaliseerde MS-gegevens van het referentieserum worden respectievelijk weergegeven in Aanvullende Gegevens 1 en Aanvullende Gegevens 2. Piekannotaties voor differentiële kenmerken worden gepresenteerd in Aanvullende Gegevens 3. De LUAD TCGA-dataset kan worden gedownload van https://portal.gdc.cancer.gov/. De invoergegevens voor het plotten van de grafiek zijn beschikbaar in de brongegevens. Brongegevens zijn beschikbaar gesteld voor dit artikel.
National Lung Screening Study Group, etc. Het verminderen van longkankersterfte met behulp van lage dosis computertomografie. Northern England. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR en Prophet, PC. Longkankerscreening met behulp van lage dosis spiraal-CT: resultaten van de National Lung Screening Study (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Vermindering van longkankersterfte door volumetrische CT-screening in een gerandomiseerde studie. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Geplaatst op: 18 september 2023